淫羊藿炮制前后對正常和腎陽虛小鼠腎上腺VC 水平的影響

吳文輝， 胡 麟， 馮 健， 李文兵， 胡昌江*

(1. 成都中醫(yī)藥大學，四川 成都610075;2. 四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司，四川 成都611930)

淫羊藿為小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornu Maxim.、箭葉淫羊藿Epimedium sagittatum (Sieb. et Zucc.)Maxim.、柔毛淫羊藿Epimedium pubescens. Maxim. 或朝鮮淫羊藿Epimedium koreanum Nakai 的干燥葉，味辛、甘，性溫，歸肝、腎經，具有補腎陽，祛風除濕，強筋健骨之功效［1-2］。中醫(yī)臨床對淫羊藿的使用主要體現在生熟異用，分為生品和炙品:生品主要用于強筋骨，祛風濕;炙品以羊脂油炙淫羊藿最為常用，主要功效也由強筋骨，祛風濕轉為補腎陽，用于陽痿遺精，虛冷不育，尿頻失禁，腎虛喘咳等［3-4］。研究表明，加熱可使淫羊藿主要活性成分黃酮的量發(fā)生變化，即加熱使淫羊藿產生更多的易于吸收的具有生物活性的黃酮，如淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ;同時淫羊藿苷在體內會水解成寶藿苷Ⅰ，而寶藿苷Ⅰ比淫羊藿苷更容易被吸收［5-8］。

維生素C (VC)又叫L-抗壞血酸，是一種水溶性維生素。主要功效為合成膠原蛋白，治療壞血病等，是腎上腺皮質內固醇合成時的重要物質。腎上腺皮質內固醇合成時會不斷消耗VC，而當腎上腺皮質功能低下時會使大量VC在體內聚集。現代研究表明下丘腦-垂體-性腺(hypothalamus-pituitary-gonadal axis，HPGA)和下丘腦是淫羊藿促性激素作用的重要途徑和靶器官，中醫(yī)臨床腎陽虛患者下丘腦-垂體-腎上腺、性腺軸多表現為低下［9-11］。因此可以通過測定腎上腺中VC的量來評價腎上腺皮質功能，作為評價藥物治療腎陽虛的生理指標之一［12-14］。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 昆明種小鼠，雄性，體質量18 ～22 g。實驗動物生產許可證號:SCXK (川)2008-24，由成都達碩生物科技有限公司提供。

1.2 實驗儀器 JY20002 電子天平(感量0.01 g，上海方瑞儀器有限公司);小型離心機FV-200 (北京中興偉業(yè)儀器有限公司);FA1204B 電子天平(感量0.000 1 g，上海精密儀器廠);控溫冰箱 (青島海爾電冰箱生產廠);UV1100H 型可見-紫外分光光度計(北京科豐恒業(yè)儀器儀表有限公司)。

1.3 實驗用藥及試劑 氫化可的松注射液(規(guī)格為10 mg/2 mL，太極西南藥業(yè)股份有限公司，批號121103);NaCl 注射液(規(guī)格為500 mL/瓶，四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號M12120821);金匱腎氣丸(北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠，批號12030713);維生素C 測定試劑盒(規(guī)格96T，北京冬歌博業(yè)生物科技有限公司，批號20130213);維生素C 對照品(規(guī)格100 mg/支，中國藥品生物制品檢定所，批號100425-201103)。

1.4 實驗藥物及制備

1.4.1 淫羊藿 購于成都藥材市場，經成都中醫(yī)藥大學藥學院胡昌江教授鑒定為小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornu Maxim。

1.4.2 羊脂油炙淫羊藿 取羊脂油加熱熔化，加入淫羊藿絲，用文火炒至均勻有光澤，取出，放涼［15］。

1.4.3 試驗藥物制備 取淫羊藿或炙淫羊藿適量，分別用10 倍量和8 倍量75%乙醇回流2 次，時間為1.5 h 和1 h，濾過，藥渣再分別用10 倍量和8 倍量水煎煮兩次，時間為1 h和0.5 h，濾過;合并75%乙醇提取液與水提液，濃縮。低劑量組濃縮至0.042 g 生藥/mL，中劑量組濃縮至0.084 g 生藥/mL，高劑量組濃縮至0.168 g 生藥/mL。

1.4.4 金匱腎氣丸 適量，搗碎，純凈水溶解，制備成質量濃度為0.25 g/mL 的混懸液，使用過程中保持磁力攪拌混勻狀態(tài)［16］。

2 實驗方法

2.1 分組及藥物劑量 取雄性小鼠240 只，按體質量隨機搭配分成16 組:空白對照組，模型對照組，陽性正常對照組，陽性陽虛對照組，生品正常低劑量組(0.83 g/kg)，生品正常中劑量組(1.67g/kg)，生品正常高劑量組(3.33 g/kg)，生品陽虛低劑量組(0.83 g/kg)，生品陽虛中劑量組(1.67g/kg)，生品陽虛高劑量組(3.33 g/kg)，炙品正常低劑量組 (0.83 g/kg)，炙品正常中劑量組 (1.67 g/kg)，炙品正常高劑量組(3.33 g/kg)，炙品陽虛低劑量組(0.83 g/kg)，炙品陽虛中劑量組(1.67 g/kg)，炙品陽虛高劑量組(3.33 g/kg)，每組15 只。除空白對照組和模型對照組給予等體積純凈水外，其余各組動物均每日灌胃給藥0.4 mL/20 g 體質量，連續(xù)16 d［17］。

2.2 腎陽虛造模方法 預防給藥3 d，第4 天起每日給藥后60 min，模型組和金匱腎氣丸組動物每天按25 mg/kg 體質量臀部皮下注射氫化可的松注射液，正常組每天注射等體積的NaCl 注射液，連續(xù)注射7 d，停藥6 d［18-19］。

2.3 腎上腺中VC提取 最后一次灌胃1 h 后處死小鼠，取雙側腎上腺置玻璃黏膜勻漿器內，精密加入0.5 mL 生理鹽水制備成黏膜勻漿，取0.15 mL 黏膜勻漿照試劑盒使用說明書分別加入試劑盒中1、2、3、4、5 號試劑進行處理，制備成待測樣品。取空白玻璃試管，精密加入0.15 mL 生理鹽水同法制備成空白溶液。

2.4 VC測定方法 取VC對照品溶液(6 μg/mL)0.4 mL置于玻璃試管中，照上法制成對照品溶液。用紫外-可見分光光度計，在536 nm 波長處測定VC對照品管的吸光度值。

2.5 腎上腺中VC水平計算公式［17］腎上腺中VC水平=［(樣品A 值-空白A 值)/ (VC對照品A 值-空白A 值)×6 μg/mL×4 ×0.5］ /腎上腺質量×100

2.6 腎上腺中VC水平降低率計算公式［17］腎上腺中VC水平降低率= (造模組腎上腺中VC水平-正常組腎上腺中VC水平)/ 造模組腎上腺中VC水平×100%

2.7 統(tǒng)計學方法 數據用Spss 17.0 統(tǒng)計軟件處理，兩組間比較用Student T 檢驗。

3 實驗結果

3.1 對正常組腎上腺VC的影響 與正常組相比:陽性組腎上腺中VC水平降低了10.71%，P ＜0.01 (P =0.005 2)，存在顯著差異;炙品正常高劑量組腎上腺中VC水平降低了7.01%，P ＜0.05 (P=0.047)，存在差異;其余各組均無表現出差異。結果見表1。

3.2 對腎陽虛小鼠腎上腺VC的影響 與空白組相比，模型組腎上腺中VC水平升高了21.16%，P ＜0.01 (P =0.006 1)，存在顯著差異，成功復制出腎陽虛模型。與模型組相比:陽性組腎上腺中VC水平降低15.51%，P ＜0.01 (P=0.004 8)，存在顯著差異;生品陽虛高劑量組腎上腺中VC水平降低了9.07%，P ＜0.05 (P =0.033)，存在差異;炙品陽虛中劑量腎上腺中VC水平降低了7.12%，P ＜0.05 (P=0.048)，存在差異;炙品陽虛高劑量組腎上腺中VC水平降低了13.94%，P ＜0.01 (P=0.005 2)，存在顯著差異。結果見表2。

表1 淫羊藿和炙淫羊藿對正常小鼠腎上腺VC 的影響(±s)

表1 淫羊藿和炙淫羊藿對正常小鼠腎上腺VC 的影響(±s)

注:陽性組與空白組比較，##P ＜0.01;給藥組與空白組比較，* P ＜0.05

組別 動物數/只劑量/(g 生藥·kg-1)腎上腺中VC/(μg·100 mg -1)降低率/%空白對照組 15 ― 306.44 ±32.94―陽性正常對照組 15 5 273.62 ±29.54## 10.71生品正常低劑量組 15 0.83 307.58 ±25.66 ―生品正常中劑量組 15 1.67 302.93 ±41.15 1.15生品正常高劑量組 15 3.33 297.43 ±34.82 2.94炙品正常低劑量組 15 0.83 309.63 ±37.21 ―炙品正常中劑量組 15 1.67 298.28 ±39.61 2.66炙品正常高劑量組 15 3.33 284.97 ±28.57*7.01

表2 淫羊藿和炙淫羊藿對腎陽虛小鼠腎上腺VC 的影響(±s)

表2 淫羊藿和炙淫羊藿對腎陽虛小鼠腎上腺VC 的影響(±s)

注:與空白組比較，## P ＜0.01;給藥組與模型組比較，* P ＜0.05

組別 動物數/只劑量/(g 生藥·kg-1)腎上腺中VC/(μg·100 mg -1)降低率/%空白對照組 15 ― 306.44 ±32.94―模型對照組 15 ― 371.29 ±24.32## ―陽性陽虛對照組 15 5 313.71 ±27.66＊＊15.51生品陽虛低劑量組 15 0.83 369.73 ±38.51 0.42生品陽虛中劑量組 15 1.67 357.28 ±29.49 3.77生品陽虛高劑量組 15 3.33 337.69 ±38.24* 9.07炙品陽虛低劑量組 15 0.83 372.78 ±30.44 ―炙品陽虛中劑量組 15 1.67 344.85 ±38.87* 7.12炙品陽虛高劑量組 15 3.33 319.52 ±40.63＊＊13.94

4 討論

4.1 由表1 可以看出，陽性對照藥物金匱腎氣丸能顯著地影響腎上腺皮質內固醇合成，增加其對生物VC的利用度。炙品高劑量組對正常小鼠腎上腺VC的水平也能起到降低的作用，說明淫羊藿經過羊脂油炮制以后，并且在大劑量下也可以增強腎上腺皮質的功能，增強其內固醇的合成。

4.2 由表2 可以看出，采用氫化可的松復制小鼠腎陽虛模型，腎陽虛小鼠腎上腺中VC水平顯著高于正常組，說明腎陽虛小鼠腎上腺皮質功能顯著下降，基本符合中醫(yī)腎陽虛概念;溫補腎陽藥“金匱腎氣丸”能顯著降低腎陽虛小鼠的腎上腺中VC的水平，提高腎陽虛小鼠的腎上腺皮質功能，可作為此實驗的陽性對照藥物;在淫羊藿生品的各組中，只有在高劑量(3.33 g/kg)作用下對腎陽虛小鼠的腎上腺VC有降低作用，說明淫羊藿其本身應該具有提高腎上腺皮質內固醇合成的功效。經過羊脂油炮制以后，其起效劑量降低，在中劑量(1.67 g/kg)時開始表現出差異，當用藥劑量達到高劑量時(3.33 g/kg)表現出明顯的差異。說明淫羊藿經過羊脂油炮制以后有助于增強氫化可的松所致小鼠的腎上腺皮質內固醇的合成，且隨劑量增高治療作用越明顯。

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