RP-HPLC內標標準曲線法測定茶油中的7種酚類物質

王進英 鐘海雁

(中南林業科技大學食品科學與工程學院1，長沙 410004)(糧油深加工與品質控制湖南省重點實驗室2，長沙 410004)

茶油是我國特有的傳統木本食用植物油之一，茶油中含有的酚類物質具有具有良好的自由基清除作用[1]，其抗氧化效果明顯優于生育酚[2]，從而能有效的抑制油脂的氧化保證茶油具有良好的儲藏穩定性[3-4]。

目前各種植物中酚類物質含量測定方法要分為總酚含量的測定[5-7]和各酚類組分單體分析[8]，這2種分析方法也應用于茶油中酚類物質的分析。丁明等[9]采用Folin-Ciocaltea 法測定了茶油中的總酚。羅凡等[10]建立了同時分離、檢測茶油中23 種酚類物質的高效液相色譜外標標準曲線法。國外，在橄欖油的研究中采用以丁香酸為內標物的內標法對橄欖油中的酚類物質進行定性和定量分析[11]。內標法標準曲線結合了峰面積歸一法和外標法，它是在加入內標物后，按峰面積歸一法進行定量，避免了由于進樣的一致性及樣品歧視效應導致的誤差，它的分析精密度也較高，是液相色譜的一種比較理想的定性和定量分析方法[12]。本試驗建立了油茶籽油中天然酚類物質含量的高效液相色譜內標標準曲線分析方法，分析測定茶油中的多酚，特別是簡單多酚，為進一步研究油茶籽油中酚類物質奠定了一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

茶油樣品如表1所示。

表1 茶油樣品信息表

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

1200型高效液相色譜儀：ZORBAX SB-C18分析型色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，美國Agilent公司；UV-1800紫外可見分光光度儀：日本島津公司；Diol 二醇基-SPE(6 mL，500 mg)固相萃取小柱：美國Supelco公司；SEP5010型固相萃取真空裝置：日本島津公司；MD200-1氮氣吹掃儀：杭州奧盛儀器有限公司；AL204型電子天平：Mettler Toledo儀器(上海)有限公司；FE20型pH計： Mettler Toledo儀器(上海)有限公司；B5510E-DTH型臺式超聲波清洗機：美國Branson公司；DW-86L628型超低溫冰箱：海爾公司；英國ELGA分析型超純水系統：上海恒奇儀器儀表有限公司。

1.2.2 試劑與標準品

沒食子酸、3，4-二羥基苯乙酸、兒茶素、4-羥基苯乙酸、丁香酸、鄰香草醛、2-羥基肉桂酸、槲皮素對照品：美國Sigma公司。甲醇：色譜純，美國TEDIA天地試劑公司；乙酸(色譜純)、乙酸乙酯(分析純):天津市化學試劑研究所；分析純正已烷：國藥集團化學試劑有限公司；超純水：英國ELGA分析型超純水系統制取。

1.3 試驗方法

1.3.1 內標標準溶液的制備

準確稱取15 mg丁香酸標準品，置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，即得內標標準溶液。

1.3.2 對照品溶液的制備

分別稱取沒食子酸對照品41.25 mg，3,4-二羥基苯乙酸對照品75 mg，兒茶素對照品81.25 mg，4-羥基苯乙酸116.3 mg，鄰香草醛對照品50 mg，2-羥基肉桂酸對照品10 mg，槲皮素對照品68 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容。經0.45 μm微孔濾膜過濾，備用。

1.3.3 供試品溶液的制備

準確稱取2. 5 g茶油，溶于6 mL正己烷中，將二醇基固相萃取柱置于真空洗脫設備中，分別連續過6 mL甲醇和6 mL正己烷，釋放真空，將油溶液過柱，此時樣品留在固相上，分別用3 mL正己烷過柱清洗2次，再用4 mL正己烷- 乙酸乙酯( 90∶10) 過柱，最后用10 mL甲醇洗柱，加入1 mL丁香酸內標標準溶液，氮吹儀吹干，殘渣溶于1 mL甲醇-水(1∶1) 中，過0. 45 μm濾膜，待測。

1.4 色譜條件

色譜柱：ORBAX SB-C18分析型色譜柱(4.6 mm×250 mm；5 μm)；柱溫： 25 ℃；檢測波長：280 nm；流動相：A(甲醇)，B(0.2%乙酸)；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL。

2 結果與討論

2.1 試驗條件的優化

2.1.1 流動相的選擇

由于酚類化合物常帶有酚羥基，在水中會部分解離。而未解離的羥基與固定相作用較強，導致拖尾。所以僅用甲醇水作流動相很難實現標樣的完全分離[13]。梯度洗脫中在水相中加入一定的酸分離效果和峰型明顯改善[14]。羅凡等[10]分別以1% 甲酸、0.1%甲酸、0.2%乙酸與甲醇作為流動相采用相同的梯度洗脫條件進行分離，結果表明 0.2%乙酸與甲醇為最適流動相。本試驗中以甲醇(A)和含0.2%乙酸的水(B)作為流動相，對油樣1選取3個洗脫程序對油樣進行洗脫，色譜圖如圖1 所示。

圖1 3種梯度洗脫分離油樣的液相色譜圖(280 nm)

由圖1可以看出，在3個洗脫梯度中，梯度3的分離效果最好，尤其是在25～35 min之間，使各物質達到了良好分離，而且基線漂移現象得到了一定改善，梯度3的洗脫程序如表2所示。

2.1.2 檢測波長的選擇

通過紫外分光光度計對8種酚類的標樣溶液在200～400 nm內進行全波長掃描，得到各物質的8種酚類物質的紫外吸收光譜圖，如圖2所示。從圖2可以看出，在215 nm和280 nm都有較強的吸收，研究表明215 nm處基線噪聲較大，檢測效果不好[15]。經試結合各種酚類物質研究文獻[16-20]中對檢測波長的選擇，在吸收波長為280 nm時，各標準品都具有較大吸收，分離效果、峰型最好，且各種酚都得到了完全分離。考察樣品在本HPLC條件下的實際吸收情況，選定280 nm為檢測波長。

圖2 各種酚類化合物的紫外吸收光譜圖

2.1.3 內標物質的選擇

內標法的關鍵是選擇合適的內標物，內標物應該是原樣品中不存在的純物質，它的性質應盡可能與被測組分相近，不與被測樣品起化學反應，同時要能完全溶于被測樣品中。內標物的峰應盡可能接近被測組分的峰，或位于幾個被測組分的峰中間，但必須與樣品中的所有峰不重疊[21]。本試驗參照國外橄欖油研究[22-24]，選定丁香酸為內標物質。

2.2 內標標準曲線與線性范圍

2.2.1 相對校正因子的測定

取1.3.2中對照品溶液注入高效液相色譜儀，平行測定6次，相對校正因子按式：f=(As×mi) /(Ai×ms) 計算，式中：As為內標物質的峰面積；Ai為對照品的峰面積；ms為內標物質溶液的質量；mi為對照品溶液的質量。測定結果如表3所示，其相對標準偏差在3.2%以內。

表3 8種組分的絕對校正因子及相對校正因子(n=6)

2.2.2 線性試驗

取“1.3.2”對照品溶液0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL置于10 mL容量瓶中，各加1 mL丁香酸內標標準溶液，加甲醇定容值刻度，制成具有濃度梯度的一系列溶液，在優化色譜條件下依次進樣分析。以各種酚類物質的峰面積與丁香酸峰面積的比值作為縱坐標(Ai/As)，以各種酚類物質的含量與丁香酸含量比值為橫坐標(mi/ms)，繪制標準曲線，進行回歸計算，得回歸方程。假設高效液相色譜儀最低相應值S=3N(N為儀器噪音水平)，以S/N=3時，所對應標準溶液中所含組分的含量為檢出限，結果見表4。7種酚類物質在各自的線性范圍內具有良好的線性關系，相關系數均大于0.998，檢出限為0.008～0.028 μg /g，能滿足定量分析的要求。

表4 7種組分的線性回歸方程、相關系數、線性范圍及檢出限

2.3 方法學考察

2.3.1 穩定性

按照“1.3.3”制備油樣3的供試樣品1份，分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣分析，記錄色譜圖。試驗結果表明，樣品在室溫條件下在0～24 h內穩定，各色譜峰的相對標準偏差在2%左右。

2.3.2 精密度

取“1.3.2”中所列對照品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，連續測定6次，測得各組分的保留時間和峰面積的RSD，以考察方法的精密度。如表5所示， 8種物質的保留時間和峰面積的RSD分別小于1.8%和3.9%，表明本法精密度較好。

表5 8種酚類物質的保留時間和峰面積精密度試驗(n=6)

2.3.3 重復性試驗

以8號油樣為樣品，按照“1.3.3”制備供試樣品6份，在優化色譜條件下進樣分析，測得7種組分的平均含量，如表6所示，RSD 小于3%。

表6 1號油樣中7種酚類物質的含量(n=6)

2.3.4 回收率

取8號油樣3份，分別加入一定濃度的混合標準溶液，按“1.3.3”樣品溶液制備方法項下制備，測定含量，計算回收率和RSD，結果見表7。從表7可以看出，各組平均回收率為在76.783%～88.956%之間，RSD在3%左右(n=3)，表明樣品在前處理過程中有一定的損失，在樣品處理過程中應進一步優化提取條件。

表7 茶油中7種酚類物質的加標回收率和相對標準偏差(n=3)

2.4 實際樣品測定

取1～7號油樣各2.5 g，按照“1.3.3”制備供試樣品3份，在已確定的色譜條件下進樣分析，測得每種物質的峰面積，根據每種物質的線性回歸方程計算出各酚類物質的含量。結果表明，在選定的7種酚類物質中，茶油中只含有其中的4種，分別為沒食子酸、兒茶素、4-羥基苯乙酸、槲皮素，7個油樣中4種酚類物質的含量如表8 所示。選定7種多酚作為標準樣品主要是根據前人的研究結果進行的[10]。但本次供試的樣品中僅檢測到其中的4種，其主要的原因可能是其余3種多酚含量較低，因此，前處理方法，如油樣提取物中多酚的富集，仍是值得研究的問題，這樣有利于較全面地認識茶油的多酚組成。

表8 茶油中4種組分含量/μg/g(n=3)

3 結論

選用丁香酸為內標物，對樣品前處理和色譜分析條件都進行優化選擇后，建立了反相高效液相色譜內標標準曲線法同時測定茶油中7種酚類物質的方法。試驗結果表明，在選定的7中酚類物質中茶油只含有其中的4種，分別是沒食子酸、兒茶素、4-羥基苯乙酸、槲皮素，而且這4種物質在8個油樣中的含量各異，這可能與茶油的加工方法和品種有關。該方法準確，適用性好，可用于茶油中酚類物質的定性與定量分析。

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