湖北恩施地區煙草青枯菌的生理分化研究

劉海龍，黎妍妍,，嚴亞琴，鄭 露，李錫宏，黃俊斌*

（1.華中農業大學植物科技學院，湖北省作物病害監測和安全控制重點實驗室，武漢 430070；2.湖北省煙草科學研究院，武漢 430030）

煙草青枯病是煙草上發生最重要的土傳病害之一，由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）侵染引起，其寄主范圍包括54個科的450余種植物[1]。1864年在印尼首先報道了青枯菌對煙草的毀滅性危害。此后，該病逐漸成為美國、日本、澳大利亞、韓國等許多產煙國家煙草重要的細菌病害[2-3]。煙草青枯病在我國主要產煙區普遍發生，其中以廣東、廣西、福建、湖南及貴州煙區危害最為嚴重[4]。近年來，由于氣候變化等原因，該病的發生范圍在我國有由南向北蔓延之勢[5]。

培育和推廣抗病品種是防治煙草青枯病最有效的措施，但由于不同地理起源或寄主來源的青枯菌具有明顯的生理分化現象[6]，極易導致篩選的抗病品種喪失抗病性。因此，進行煙草青枯菌的生理分化研究對選育和推廣抗病品種具有重要作用。

目前，國際上公認的青枯菌亞分類系統有：一是根據青枯菌侵染的寄主范圍和對3種雙糖和3種己醇的利用能力分別將其劃分為5個生理小種（r1，2，3，4，5）和6個生化型（bvⅠ，Ⅱ，ⅡT，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ）[7-10]；二是由Fegan和Prior等提出的將青枯菌劃分為 4個演化型（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ），每個演化型又可進一步劃分為一系列的序列變種（sequevar）[11-12]。迄今為止，國內外已有較多關于煙草青枯病菌生理分化的研究報道；美國、韓國等國家已對本地區的煙草青枯菌菌系分化情況進行了深入研究[13-14]；我國部分地區如山東、江西、四川、湖南、安徽等也已開展了煙草青枯菌的生理小種和生化型鑒定研究[15-19]；參照新的青枯菌劃分體系并對福建、廣西、貴州等地的煙草青枯菌演化型進行了鑒定[20-21]。而在湖北省未見煙草青枯病菌生理小種、生化型或演化型的相關報道。恩施地區作為湖北省最大的產煙區，其煙草青枯病的發生日趨嚴重；因此，有必要對該煙區的煙草青枯菌生理小種、生化型及演化型進行鑒定。

本研究參照傳統的生理小種和生化型鑒定方法，結合國際最新的青枯菌演化型分類體系，旨在初步探究湖北省恩施煙區煙草青枯病菌的生理分化情況，為湖北省煙草青枯病的防控及煙草的抗病育種工作提供必要的理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株分離、鑒定

2013年6—9月分別于湖北省恩施州的宣恩、咸豐、利川等8個縣（市）煙田采集煙草青枯病病株樣品64份。采用稀釋劃線分離法[22]，在TTC培養基上進行劃線，觀察分離結果。挑取疑似青枯菌野生型菌落轉接于NA平板，30 ℃條件下培養48 h后，挑菌于無菌水中 20 ℃下保存備用。采用已報道青枯菌種的特異性引物759F?760R對分離菌株進行分子鑒定[10]，根據擴增條帶大小進一步確定分離菌株是否為青枯菌。

1.2 生理小種測定

采用注莖接種法[18]，將供試菌株（濃度為108cfu/mL）分別接種青枯菌鑒別寄主煙草、番茄、茄子、馬鈴薯、花生和辣椒，每個菌株每種寄主接種2株，設立3次重復，每種寄主植物取6株接種無菌水作為對照，接種后置于溫度 30 ℃，濕度大于80%的溫室誘導發病，接種2 d后開始檢查發病情況，10 d后統計發病結果。根據供試菌株接種寄主的抗感反應確定生理小種歸屬。

1.3 生化型鑒定

參照Hayward的方法[10]，分別將3種雙糖（乳糖、麥芽糖和纖維二糖）和3種己醇（甘露醇、山梨醇和甜醇）配成10%的溶液，滅菌（3種雙糖用過濾法滅菌，3種己醇經121 ℃蒸氣滅菌）后分別加入基本培養基中，使其終濃度為 1%。而后將供試菌株分別移至含不同碳水化合物的測定培養基上，在30 ℃的恒溫培養箱中培養21 d。根據供試菌株對3種雙糖和3種己醇的利用情況，即培養基的顏色變化，確定各菌株的生化型分類歸屬。

1.4 演化型鑒定

選用 MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction試劑盒（ver2.0，大連寶生物工程有限公司）提取供試菌株基因組DNA。PCR擴增采用25μL反應體系，其中包括10×PCR buffer，Taq酶2U，MgCl21.5 mM，dNTPs 200 μM，引物759F和760R各 4 pmol，引物 Nmult21:1F，Nmult21:2F，Nmult23:AF，Nmult22:InF，Nmult22:RR（由武漢擎科創新生物科技有限公司合成，表1）各6 pmol，DNA模板50 ng，ddH2O補足25 μL。反應程序為96 ℃，5 min；94 ℃，15 s；59 ℃，30 s和72 ℃，30 s，30個循環；72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR產物于1.8%的瓊脂糖凝膠中電泳，通過Biorad凝膠成像儀觀察結果。根據PCR擴增片段大小確定供試青枯菌菌株的演化型。

2 結 果

2.1 青枯菌菌株分離、鑒定

2013年6—9月在湖北恩施地區8個縣（市）上采集病株，通過TTC培養基分離得到54個青枯菌野生型（菌落較大，稍凸起，不規則圓形，中央粉紅色，邊緣乳白色，白邊較寬）菌株，通過青枯菌種特異性引物進行擴增，結果表明，54個菌株均能擴增得到大小為280 bp的條帶（圖1）進一步確定54個菌株均為青枯菌。分離菌株編號見表2。

2.2 生理小種鑒定結果

通過供試菌株接種青枯菌生理小種鑒別寄主后的抗感反應，來確定其生理小種的歸屬。對6種寄主植物注莖接種2~3 d后的結果表明，54個煙草青枯菌菌株對6種鑒別寄主均有致病作用，發病率為 100%，癥狀表現為注射區初有褪綠斑，逐漸變的3個主栽煙草品種云煙87、畢納1號和鄂煙1號黑褐色，而后向四周擴展，引起葉片萎蔫，最終整個植株枯萎死亡；因此，根據侵染的植物種類范圍，可將所有供試菌株劃分為生理小種1號。

2.3 生化型鑒定結果

根據青枯菌對3種雙糖和3種己醇的利用情況來確定供試菌株的生化型。鑒定結果表明，各菌株接種不同培養基后，培養基初為藍綠色，在細菌生長過程中培養基逐漸變為黃色，這表明細菌氧化利用了培養基中糖或醇并產酸，pH下降，使培養基中的溴百里酚藍在酸性條件下變色。54個供試菌株均能利用3種雙糖和3種己醇，依據青枯菌生化型劃分標準，將其劃分為生化型Ⅲ。

圖1 多重PCR鑒定煙草青枯菌演化型Fig.1 The phylotypes of Ralstonia solanacearum identified by multiplex-PCR

表2 煙草青枯菌菌株來源Table 2 Original source of Ralstonia solanacearum strains

2.4 演化型鑒定結果

根據最新的青枯菌演化型分類體系，采用PCR檢測體系對 54個供試菌株的基因組 DNA進行擴增。結果表明，54個菌株均可同時擴增到片段大小分別為280 bp和144 bp的2條特異性片段（表2、圖1）。其中大小為280 bp的片段為青枯菌特異性擴增條帶；144 bp的片段為演化型Ⅰ的特異性擴增條帶。由此可知，供試的 54個青枯菌菌株均屬于演化型Ⅰ。

3 討 論

作為傳統的青枯菌菌系劃分標準，生理小種和生化型的劃分存在一定的局限性，即不能有效地反應出病原菌在進化及地理起源上的差異[11]。隨著分子生物學的發展，Fegan等[11]提出了1個新的分類體系，將青枯菌分為4個不同的演化型，用于描述青枯菌種以下的差異。美國、韓國等國已進行了煙草青枯菌的生理分化研究，報道的全部生理小種測定結果為生理小種1號，而生化型和演化型的結果則不完全相同。其中美國報道的煙草青枯菌屬于生化型Ⅰ，演化型Ⅱ[13]；韓國的煙草青枯菌屬于生化型Ⅲ和Ⅳ，演化型Ⅰ[14]。在我國山東、江西、四川、湖南、安徽等地區已報道的青枯菌生理小種和生化型鑒定結果中，煙草青枯菌屬于生理小種1號，生化型存在Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ4個型，其中大部分菌株屬于生化型Ⅲ和Ⅴ[15-19]。對福建、貴州、廣西、廣東等地的煙草青枯菌演化型進行了鑒定，鑒定結果顯示這些省份的煙草青枯菌屬于演化型Ⅰ型[12,20-21]。

4 結 論

本研究從湖北省恩施州宣恩、咸豐、利川和巴東等主要產煙縣（市）的感病煙株上分離得到 54個青枯菌菌株，對其生理小種、生化型和演化型進行鑒定，將所有菌株均劃分為生理小種1號，生化型Ⅲ和演化型Ⅰ。從研究結果來看，湖北恩施地區煙草青枯菌群體結構較為單一，生理分化現象不明顯，這對該地區篩選和利用煙草青枯病抗病品種是一個較為有利的條件，在煙草抗青枯病育種過程中，可以適當的培育和引進一些針對生化型Ⅲ和演化型Ⅰ菌株選育出的新的煙草抗病品種；盡管如此，青枯菌群體具有極強的適應性，隨著栽培品種的不斷更替，青枯菌會不斷發生生理分化，表現不同的生化型。而根據演化型分類框架，每個演化型還可進一步劃分為多個序列變種。因此，我們今后還需要分離更多煙草青枯菌，并對青枯菌序列變種水平或更詳細分類水平的差異進行分析，為培育和篩選抗病煙草品種提供理論依據。

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