加工工藝對蜂蜜揮發性成分的影響

任佳淼，彭文君，田文禮，方小明，趙亞周

（中國農業科學院蜜蜂研究所，國家蜂產品加工技術研發中心，北京 100093）

加工工藝對蜂蜜揮發性成分的影響

任佳淼，彭文君，田文禮，方小明，趙亞周*

（中國農業科學院蜜蜂研究所，國家蜂產品加工技術研發中心，北京 100093）

采用成熟的加工工藝對馬占相思樹（Acacia mangium）蜂蜜進行加工，再利用氣相色譜-質譜聯用分析不同加工節點蜂蜜樣品中的揮發性成分。結果顯示，加工過程中各加工節點蜂蜜樣品中的揮發性成分相近，共檢測到23 種物質，分屬于酯類（26.09%）、醛類（13.79%）、醇類（13.79%）、酮類（13.04%）、萜烯類（8.70%）、烷烴類（8.70%）和酸類（4.35%）等，其中糠醛、苯甲醛和苯乙醛可能對蜂蜜風味具有重要貢獻；在加工過程中，融蜜可導致蜂蜜樣品的揮發性成分損失較大，通過對融蜜條件進行優化，得到融蜜條件為加熱至71 ℃保持4 min，此時蜂蜜揮發性成分的損失程度較低。本研究可為蜂蜜加工過程中的風味控制和商品化蜂蜜的真實性檢測提供一定的理論依據。

馬占相思樹；蜂蜜；加工工藝；揮發性成分；氣相色譜-質譜

蜂蜜是蜜蜂（Apis mellifera L.）直接從植物花朵蜜腺上采集的花蜜，儲存于蜂巢中釀造而成，其可以與蜂花粉混合制成蜂糧，供工蜂和雄蜂個體食用[1-2]。隨著生活水平的提高，人們對蜂蜜的需求量增長迅速，對其食用品質的要求也越來越高。生產者不得不對蜂蜜的產品質量和生產能力進行現代化升級，以適應市場的需求[3]。與其他食品一樣，蜂蜜具有獨特的感官特征，包括了特殊的色澤、甜度和香氣等，決定著消費者的喜好[4]。天然蜂蜜具有特殊的花香氣味，主要源于不同的揮發性小分子化合物，這些揮發性成分主要由以下幾個方面產生：1）直接來自于植物或花蜜；2）蜜蜂對植物成分的轉變或者直接由蜜蜂產生；3）蜂蜜在加工或儲存過程中的加熱或者其他處理過程中產生；4）來源于微生物或者環境污染[5]。蜂蜜中主要的揮發性成分有醇類、酮類、醛類、酸類和萜烯類等[6]。某些揮發性成分可以作為特征組分用以鑒定特定蜂蜜的蜜源，如柑橘蜂蜜中半揮發性的氨茴酸甲酯[7]，桉樹蜂蜜中的2-羥基-5-甲基-3-己酮和3-羥基-5-甲基-2-己酮[8]，栗樹蜂蜜中的2-氨基乙酰苯等[9]。如何能夠保證蜂蜜在商業化加工過程中的純正性，即避免或降低特征風味組分的損失，成為蜂蜜加工領域改進工藝的一個重要出發點。用科學方法從巢脾中取出的成熟蜂蜜（波美度大于42），通常能保持其固有的營養和風味[10]。但是，實際生產中由于質量價格體系的不合理，促使蜂農生產出大量不成熟蜂蜜（波美度低于40），需要經過適當的加工，才能有效地提高品質和延長貨架期。為此，通過對蜂蜜加工工藝各個節點的樣品進行風味分析，有助于明確蜂蜜中有效揮發性成分的損失環節，以便改進生產工藝，提高商品化蜂蜜的質量。

常用的食品風味研究方法有化學法、光譜法和色譜法，其中前兩種方法只能測定一種或一類成分，而色譜法可以同時考察多種風味成分，為食品風味物質對比研究帶來便利[11]。目前為止，已有超過600 種有機成分從不同蜂蜜的揮發性成分中鑒別出來[12]。Zhou等[13]采用感官分析和氣相色譜-嗅聞-質譜（gas chromatographyolfactometry-mass spectrometry，GC-O-MS）相結合的技術對蕎麥蜂蜜香氣活性成分進行了鑒定，3-甲基丁醛、葫蘆巴內酯和（E）-β-大馬酮是含量最高的揮發性成分，其中3-甲基丁醛是蕎麥蜂蜜麥芽糖風味的主要活性成分。Ribeiro等[14]采用氣相色譜-氫火焰離子化檢測器-質譜（gas chromatography-flame ionization detector-mass spectro metry，GC-FID-MS）從巴西酒神菊（Vernonia sp.）蜂蜜中分離到31種揮發性成分，其中醇類、烴類、酸類、酯類和芳香族成分最豐富。夏立婭等[15]采用氣相色譜法檢測了棗花（Zizyphus jujuba）蜂蜜中的揮發性成分，并建立了其指紋圖譜。涂世等[16]采用GC-FID-MS技術分析49 個不同產地油菜（Brassica campestris）蜂蜜樣品的揮發性成分，可以明顯區分其中的原料蜂蜜和加工后蜂蜜，并推斷苯甲酸-4-羥基-3,5-二甲氧基-酰肼可作為油菜蜂蜜蜜源的標記物。

總體來說，關于不同蜜源蜂蜜風味和揮發性成分的研究較多，所采用的方法多以GC-MS技術為基礎，其不失為一種有效的研究方法，但是針對蜂蜜加工過程中不同工藝節點樣品的揮發性成分研究鮮見報道。在此背景下，本實驗以馬占相思樹蜂蜜為材料，采用頂空固相微萃取技術（head space-solid phase micro extraction，HSSPME）對加工工藝不同節點樣品進行揮發性成分萃取，再利用GC-MS技術對揮發性成分進行分析鑒定。以期找到蜂蜜加工過程中風味保持的關鍵控制點，旨在為蜂蜜加工工藝優劣的評測及為商品化蜂蜜的標準化和風味優化方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬占相思樹蜂蜜原料于2011年在馬來西亞沙撈越州意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica）蜂場采收；系列烷烴（C7～C22，色譜純） 北京化學試劑公司；2-甲基-3-庚酮（內標化合物，色譜純） 美國Sigma-Aldrish公司。

1.2 儀器與設備

6890N-5975C氣相色譜-質譜聯用儀（配有電子電離（electron ionization，EI）離子源和NIST 2.0數據處理系統） 美國Agilent公司；TDS3/TDSA2熱脫附系統、Tenax柱（填料為2,6-二苯基-p-苯烯基氧化物） 德國Gerstal公司；HH-1恒溫水浴鍋 金壇市至翔科教儀器廠；DB-WAX毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）美國J&W公司。

1.3 方法

1.3.1 蜂蜜加工

原料蜂蜜委托北京中蜜科技發展有限公司南口生產基地進行加工，其主要的工藝流程為：原料→融蜜（71 ℃，2 min）→過濾→濃縮→滅菌→灌裝。本實驗從各加工工藝節點進行取樣，樣品取好后密封冷凍（-20 ℃）保存。另外，實驗對融蜜環節的加熱溫度和加熱時間進行了重新優化，以期在加工過程中降低蜂蜜黏度的同時，盡量減少蜂蜜揮發性成分的損失，提高加工效率和產品質量。具體的取樣方式如表1所示。

表1 不同加工工藝節點的取樣方式Table1 Sampling scheme at different processing stages

1.3.2 HS-SPME條件

稱取蜂蜜樣品8 g置于頂空瓶內，用微量進樣器加入1 μL，1.632 μg/mL的2-甲基-3-庚酮（內標，正丁烷溶解），密封狀態下50 ℃平衡30 min。將SPME的萃取頭插入頂空瓶中，推出纖維頭后50 ℃吸附40 min。

1.3.3 自動熱脫附系統條件

起始溫度為35 ℃，保持0.5 min，延遲3 min；60 ℃/min的速度升溫至230 ℃，保持1 min，熱脫附系統與進樣口之間傳輸線溫度為300 ℃。內附的冷進樣系統條件為：初始溫度-100 ℃，平衡0.2 min，以10 ℃/min的速度升溫至280 ℃，保持0.5 min。

1.3.4 氣相色譜條件

彈性石英DB-WAX毛細管柱；柱溫條件為程序升溫，初始溫度為40 ℃，保持3 min，5 ℃/min速度升溫至200 ℃，再以10 ℃/min速度升溫至240 ℃，保持5 min；載氣為氦氣（純度＞99.999%），保持恒定流速1.2 mL/min；進樣口溫度250 ℃；不分流。

1.3.5 質譜條件

電子電離（electron ionization，EI）源；離子源溫度230 ℃；電子能量70 eV；傳輸線溫度280 ℃；四極桿溫度150 ℃；溶劑延遲3 min；質量掃描范圍m/z 55～500。

1.3.6 化合物的鑒定

1.3.6.1 定性

主要通過2 種途徑：利用設備中NIST 2.0數據庫檢索目標化合物，進行定性分析；采用相同條件對正構系列烷烴（C3～C27）進行GC-MS分析，利用色譜峰的保留時間計算目標相應化合物的保留指數LRI值，并與在數據庫[17]中查詢的LRI值比對（認定范圍為相差0～100內），實現化合物的輔助定性。色譜峰LRI值計算公式：

式中：ta為色譜峰a的保留時間；tn為正構烷烴Cn的保留時間（色譜峰a的保留時間須在正構烷烴Cn和Cn+1之間）。

1.3.6.2 定量

根據蜂蜜樣品中添加的內標化合物含量、內標化合物色譜峰面積及目標化合物色譜峰面積，計算目標化合物的含量，計算公式為：

式中：CX為目標化合物的質量濃度；SX為目標化合物的色譜峰面積；CA為內標化合物的質量濃度；SA為內標化合物的色譜峰面積。

2 結果與分析

2.1 蜂蜜揮發性成分總離子流圖

對不同蜂蜜樣品的揮發性成分進行GC-MS檢測，所有樣品的總離子流圖輪廓相似，其中以S2樣品為例進行描述，具體見圖1。

本實驗中，蜂蜜加工過程中各工藝節點所取樣品的揮發性成分相近，差別多集中于同一成分的不同峰度值上，即所有樣品的整體風味輪廓較為相似，揮發性成分的含量不同。頂空固相微萃取技術可以很好地吸附蜂蜜樣品中的揮發性成分，通過GC-MS的分析檢測，可以得到良好的總離子流圖，其中各組分峰分離完全，較少出現重疊現象。GC-MS分析過程中，蜂蜜樣品中揮發性成分最早出現于5 min左右，而最遲出現于33 min左右，整個分析過程持續28 min左右。

圖1 S2樣品揮發性成分的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatile components in sample S2

2.2 蜂蜜樣品中揮發性成分的定性

表2 蜂蜜樣品中揮發性成分的定性分析Table2 Qualitative analysis of volatile components in honey samples

各蜂蜜樣品中揮發性成分分別經MS所配置的NIST 2.0數據處理系統檢索目標化合物，匹配度和純度大于800作為標準進行鑒定，并利用化合物保留指數LRI值比對，對蜂蜜中揮發性成分進行定性分析，結果見表2。所有蜂蜜樣品中揮發性成分共檢索得到23 種，其中14 種經過了質譜庫和LRI值的雙重鑒定，結果較為可信。值得注意的是，揮發性成分中含有糠醛、苯甲醛、5-甲基-2-呋喃甲醛和苯乙醛4 種醛類物質，尤其是糠醛、苯甲醛和苯乙醛在所有樣品中均被檢測到，說明其很可能是馬占相思樹蜂蜜揮發性組成中的特征成分。另外，揮發性成分中還含有乙酸乙酯、苯甲酸乙酯、乙酸苯乙酯、猛殺威、癸內酯和鄰苯二甲酸甲酯等酯類物質，其也可能對蜂蜜的揮發性組分來源有所貢獻。

2.3 蜂蜜樣品中揮發性成分分類

圖2 蜂蜜樣品中揮發性成分種類Fig.2 Classification of volatile components in honey samples

根據表2數據，將蜂蜜樣品中揮發性成分進行分類匯總，見圖2。揮發性成分中酯類、醛類和醇類物質含量最高，分別為26.09%（6種）、17.39%（4 種）和17.39% （4 種），也印證了酯類和醛類物質可能是蜂蜜香味的主要源。在蜂蜜的揮發性組分中還發現了其他類物質，分別為酮類（13.04%）、萜烯類（8.70%）、烷烴類（8.70%）和酸類（4.35%）等。

2.4 加工工藝對蜂蜜中揮發性成分的影響

圖3 加工工藝對蜂蜜揮發性成分的影響Fig.3 Effect of processing stages on volatile components in honey

本實驗中所采用的蜂蜜加工程序為比較成熟的工藝技術，主要步驟包括：原料→融蜜（71 ℃，2 min）→過濾→濃縮→滅菌→灌裝，各步驟樣品的揮發性成分總含量變化形式見圖3?？傮w來看，原料和濃縮后樣品的揮發性成分總含量較高，融蜜和過濾后樣品的揮發性成分損失較大，說明融蜜條件是揮發性成分保持的重要影響因素?；诖?，繼續針對加工工藝中的融蜜條件進行優化。

2.5 融蜜條件對蜂蜜中揮發性成分的影響

融蜜條件主要包括融蜜溫度和融蜜時間，根據實際操作經驗，優化實驗分別設置了60～77 ℃的溫度范圍，及相應的融蜜時間。從各融蜜條件進行取樣，分析其揮發性成分的總含量，具體結果見圖4。隨著融蜜溫度的升高，蜂蜜樣品中揮發性成分的總含量總體呈現降低的趨勢，且60～71 ℃變化程度較大，71～77 ℃變化程度較小。隨著融蜜時間的延長，蜂蜜樣品中揮發性成分的總含量也呈現逐漸降低的趨勢，但是變化程度較為平緩，其中71 ℃加熱4 min時，揮發性成分總含量相對較高。

圖4 融蜜條件對蜂蜜揮發性成分的影響Fig.4 Effect of thaw conditions on volatile components in honey

3 討 論

本實驗采用HS-SPME對不同加工環節的蜂蜜樣品進行揮發性化合物的萃取，萃取物經熱脫附系統自動進樣，經DB-WAX毛細管柱分離，再利用GC-MS對其中的揮發性化合物進行定性與定量分析。結果顯示，馬占相思樹蜂蜜的揮發性成分中共檢測到了23 種物質，其中包括酯、醛、醇、酮、萜烯、烷烴和酸7 類物質。其揮發性組分中所含物質種類與其他蜜源蜂蜜相似，但具體所含物質差別較大，尤其是特征性的揮發性成分。如紫云英蜂蜜揮發性成分中含有醇、醛、酯等，其中鄰苯二甲酸二異辛酯含量較高[18]；油菜蜂蜜揮發性成分中含有醇、醛、酮酯、脂肪酸、苯及萘的衍生物等[17]，且其中多含有苯乙醛[19]；蕎麥蜂蜜揮發性組分中含有3-甲基丁醛、2,3-丁二酮、苯乙醛、3-甲基酪酸、香草醛、甲酚、香豆素等，其中3-甲基丁醛為特征成分[13]。導致上述差異的原因包括了不同的蜜源、地域、季節和蜂種等，而蜜源是最主要的影響因素[20]。本研究中各蜂蜜樣品間所含揮發性物質種類沒有差別，但是由于各類物質間呈味閾值不同，所以風味貢獻程度存在明顯差別。酯類和醛類物質含量均較高，并且糠醛、苯甲醛和苯乙醛在所有樣品中均能檢測到，與前人報道一致[19,21]，說明醛類可能是影響馬占相思樹蜂蜜風味的主要物質。醛是食品中最重要的香味物質之一，其風味閾值一般很低，有時低含量時便可使食品產生特征香味[22-23]。酯類物質也是一種很重要的風味物質，很多酯類的風味閾值非常低，雖然質量分數不高，但是對風味形成的作用很大[24]。醇類物質在馬占相思樹蜂蜜的揮發性成分中也較多，但是由于其風味閾值高，其對蜂蜜的風味貢獻不大。蜂蜜揮發性成分中其他類化合物種類數量少，可能對風味的貢獻不大。通過對不同加工工藝節點的蜂蜜樣品揮發性成分的分析，發現原料和濃縮后樣品的揮發性成分總含量較高，而融蜜和過濾后樣品的揮發性成分損失較大。其中濃縮可引起蜂蜜體積縮小，進而導致揮發性成分升高，故融蜜是蜂蜜風味保持的重要影響因素。本實驗中所采用的加工工藝中融蜜條件為加熱至71 ℃保持2 min，通過對融蜜條件的進一步優化，我們發現71 ℃加熱4 min時，揮發性成分總含量相對較高。如果融蜜溫度低（如60 ℃）則不足以去除蜂蜜的結晶并實現透明均一化，達不到融蜜的效果，而溫度過高（如77℃）則易導致蜂蜜中營養成分的損失及風味的破壞。商品化蜂蜜的加工工藝不盡相同，但總體流程相似，均需經過過濾、融蜜、濃縮、滅菌等關鍵步驟[25]，同時這些步驟也是導致蜂蜜風味損失的原因所在。本研究結果最終確定了影響馬占相思樹蜂蜜揮發性成分的重要因素，同時對其進行了進一步優化，以期從風味保持的角度出發，為保證商品化蜂蜜的真實性提供理論依據。

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Effect of Processing Steps on Volatile Components in Honey

REN Jia-miao, PENG Wen-jun, TIAN Wen-li, FANG Xiao-ming, ZHAO Ya-zhou*
(National R &D Center for Bee Product Processing, Institute of Apiculture, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100093, China)

Honey samples from the flowers of Acacia mangium collected from different processing stages were analyzed for volatile components by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The results showed that the volatile composition of honey was similar across different processing stages. Twenty-three volatile components were detected which belonged to esters (26.09%), aldehydes (13.79%), alcohols (13.79%), ketones (13.04%), terpenes (8.70%), alkanes (8.70%), acids (4.35%), and so on. Furfural, benzaldehyde and benzeneacetaldehyde may play an important role in the flavor of honey. At the thawing stage, honey lost great amounts of volatile compounds and the losses could be reduced by heating to 71 ℃, holding for 4 min. These results could provide theoretical basis for flavor controlin honey processing and authentication of commercial honey.

honey; Acacia mangium; processing stages; volatile components; GC-MS

S896.6

A

1002-6630（2014）10-0041-05

10.7506/spkx1002-6630-201410008

2013-08-05

國家現代農業（蜜蜂）產業技術體系建設專項（NYCYTI-43-KXJ17）

任佳淼（1989—），女，碩士研究生，研究方向為蜂產品科學。E-mail：rjm198912090918@qq.com

*通信作者：趙亞周（1983—），男，助理研究員，碩士，研究方向為蜂產品科學。E-mail：zhaoyazhou@caas.cn