基于N-羧甲基殼聚糖釓基磁共振造影劑的制備及性能

張長(zhǎng)麗 顧費(fèi)晨 陳昌云 陸國(guó)飛 蔡雯希

(1南京曉莊學(xué)院生物化工與環(huán)境工程學(xué)院，南京 211171)

(2南京大學(xué)配位化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210093)

磁共振成像 (Magnetic resonance imaging，MRI)具有安全、快速及高分辨率顯示不同組織的精細(xì)對(duì)比等特點(diǎn)，廣泛用于醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域[1-4]。磁共振造影劑是磁共振成像的重要輔助工具，可提高成像質(zhì)量并擴(kuò)展診斷范圍[5]。目前臨床所用造影劑主要為釓基配合物(如Gd-DTPA，Gd-DOTA)，這類造影劑具有穩(wěn)定性高、水溶性好及滲透壓低等優(yōu)點(diǎn)[6]，但其在體內(nèi)停留時(shí)間短、易解離、弛豫率較低[7]。配體分子量的增加有助于配合物弛豫率的提高[8]。殼聚糖(CS)是來(lái)源廣泛的天然大分子，生物相容性好，殼聚糖經(jīng)羧甲基化反應(yīng)后生成的一類殼聚糖衍生物稱為羧甲基殼聚糖(carboxymethyl chitosan，CMCS)。羧基的引入使羧甲基殼聚糖的水溶性和金屬離子結(jié)合能力大大提高，其中N-羧甲基殼聚糖(NCMCS)可作為一種性能優(yōu)良的造影劑成分[9]。

Scheme 1 化合物DTPAA、DTPA-CS及DTPA-NCMCS的合成路線Scheme 1 Synthesis of compounds DTPAA,DTPA-CS and DTPA-NCMCS

本文將NCMCS與DTPA共價(jià)鏈接形成新配體，不僅DTPA對(duì)Gd（Ⅲ）具有很強(qiáng)配位能力，殼聚糖主鏈糖環(huán)側(cè)面大量的羥基和氨基也可能會(huì)對(duì)Gd（Ⅲ）形成附加配位作用[10]，使該金屬配合物在近生理?xiàng)l件下具有良好的穩(wěn)定性。另外，聚合殼聚糖在水中以纏繞團(tuán)聚的分子構(gòu)象存在[11]，這更有利于防止金屬離子外泄，從而實(shí)現(xiàn)降低毒性的目的。此外，引入較大分子量的NCMCS可增加配合物的分子量，從而增加配合物的弛豫性能。

本文用紅外光譜對(duì)合成的配體及配合物Gd-(DTPA-NCMCS)和 Gd-(DTPA-CS)進(jìn)行了表征，用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀 (ICP-MS)分析了配合物中Gd（Ⅲ）的含量。進(jìn)而研究了配合物的生物相容性和縱向弛豫性能，初步探討了其作為潛在磁共振成像造影劑的應(yīng)用價(jià)值，為擴(kuò)展N-羧甲基殼聚糖在磁共振成像領(lǐng)域中的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

殼聚糖(CS，脫乙酰度不低于95%，粘度100～200 mPa·s)及羧甲基殼聚糖(NCMCS，10～1 000 mPa·s)均來(lái)自阿拉丁公司，合成中常用試劑和溶劑均為國(guó)內(nèi)商業(yè)試劑。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中所用的各類無(wú)機(jī)鹽均為Aldrich或Alfa的分析純?cè)噭疄榻?jīng)MILIPORE處理的超純水。紅外光譜表征由BRUKERVECTOR22傅立葉變換紅外光譜儀完成，配合物弛豫時(shí)間測(cè)試在SIEMENS公司Trio 3T磁共振成像設(shè)備上完成的，圖像處理軟件為Image J。配合物中Gd（Ⅲ）含量與細(xì)胞內(nèi)Gd（Ⅲ）濃度的測(cè)定在Thermo公司的X SeriesⅡ電感耦合等離子體質(zhì)譜儀上完成。

1.2 配合物Gd-(DTPA-NCMCS)、Gd-(DTPA-CS)和Gd-DTPA的合成

1.2.1 二乙三胺五乙酸二環(huán)酸酐(DTPAA)的合成[12]

稱取 3.93 g(10 mmol，1 equiv.)DTPA懸浮于3.78 mL乙酸酐(40 mmol，4 equiv.)和 5 mL吡啶(60 mmol，6 equiv.)混合反應(yīng)液中，攪拌回流 1 h，抽慮，分別用乙酸酐和無(wú)水乙醚洗3～5次，40℃下真空干燥至恒重，得白色粉末2.81 g，產(chǎn)率為78.5%。

1.2.2 DTPA-CS的合成[13]

稱取5.0 g殼聚糖(31 mmol氨基葡萄糖單元)溶于100 mL含10%醋酸的水溶液中，加入400 mL甲醇，再加入46.0 g(117 mmol)DTPAA，室溫?cái)嚢?4 h。抽濾，沉淀和乙醇混合繼續(xù)攪拌12 h。再抽濾，沉淀與pH值為11的NaOH溶液混合攪拌12 h。抽濾，沉淀用超純水反復(fù)洗滌，直到洗液呈中性。用無(wú)水乙醇重結(jié)晶，真空干燥，得白色固體6.2 g。

DTPA-NCMCS的合成方法同DTPA-CS，DTPANCMCS產(chǎn)物為黃色固體。

1.2.3 Gd-(DTPA-CS)配合物的合成[13]

稱取 0.45 g(1 mmol，1 equiv.)的 Gd(NO3)3·6H2O溶于5 mL含1%醋酸的水溶液中，稱取0.24 g的DTPA-CS溶于另外5 mL含1%醋酸的水溶液中。將兩種溶液混合，60℃攪拌24 h。濃縮反應(yīng)液，加入一定量的無(wú)水乙醇，攪拌10 min后抽濾，用無(wú)水乙醇洗滌3次，真空干燥，得0.26 g棕色固體。

配合物Gd-(DTPA-NCMCS)的合成方法同配合物 Gd-(DTPA-CS)，配合物Gd-(DTPA-NCMCS)也為棕色固體。

1.2.4 Gd-DTPA的合成[14]

稱 取 4.51 g(10 mmol，1 equiv.) 的 Gd(NO3)3·6H2O溶于10 mL蒸餾水中。稱取4.13 g(10.5 mmol，1.05 equiv.)的 DTPA溶于 25 mL水中，滴加 2 mol·L-1的NaOH溶液使其溶解。將DTPA溶液滴加到硝酸釓溶液中，用2 mol·L-1的NaOH溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH值至6.8，80℃反應(yīng)12 h。將反應(yīng)液濃縮，加入適量的乙醇，析出固體，抽濾，用乙醇洗滌，真空干燥，即得白色固體Gd-DTPA，產(chǎn)率為82%。

1.3 配合物中Gd（Ⅲ）含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的配合物Gd-(DTPANCMCS)、Gd-(DTPA-CS)和 Gd-DTPA；加入高純濃硝酸室溫消解48 h，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的H2O2室溫反應(yīng)4 h，定容(硝酸的含量小于1%)，用ICPMS檢測(cè)Gd（Ⅲ）的含量。

1.4 體外配合物穩(wěn)定性測(cè)定[15]

配制 Gd（Ⅲ）的濃度為 2 mmol·L-1配合物 Gd-(DTPA-NCMCS)、Gd-(DTPA-CS)和 Gd-DTPA 溶液(含1%醋酸，0.9%NaCl水溶液)； 分別加入 Na2C2O4，終濃度為 20 mmol·L-1；混勻，37 ℃孵育 24 h；離心，取上清；加入高純濃硝酸室溫消解48 h，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的H2O2室溫消解4 h，定容；用ICP-MS檢測(cè)溶液中Gd（Ⅲ）的含量。

1.5 體外馳豫性能研究

1.5.1 縱向弛豫率(r1)的測(cè)定

分別配制一系列不同濃度的配合物的水溶液，濃度分別為 0.0，0.4，0.8，1.2，1.6 和 2.0 mmoI·L-1。弛豫時(shí)間T1通過核磁共振與成像分析儀 (imaging&analyzing system)中的反轉(zhuǎn)恢復(fù)系列(inversionrecovery sequence)測(cè)得(32 ℃，3 T)。 r1(L·mmol-1·s-1)根據(jù)式：(1/T1)溶液=(1/T1)水+r1cM得到，cM為溶液中Gd（Ⅲ）的物質(zhì)的量濃度(mmol·L-1)。

1.5.2 體外T1加權(quán)成像

體外T1加權(quán)成像通過成像分析儀 (imaging&analyzing system)中的多層自旋回波序列(Multiple spin echo sequence；MSE)測(cè)得，參數(shù)設(shè)置如下：重復(fù)時(shí)間TR=6000 ms，回波時(shí)間TE=7.2 ms，掃描次數(shù)NS=12， 層厚 Slice thickness=2.5 mm。將 2.0 mmol·L-1的配合物和作為對(duì)照的Gd-DTPA水溶液稀釋成濃度分別為 0.0，0.5，1.0，1.5 和 2.0 mmol·L-1濃度的溶液。體外T1加權(quán)成像信號(hào)值通過Image J軟件進(jìn)行分析。

1.6 細(xì)胞毒活性測(cè)定

按照1×106cm-2的密度將HeLa細(xì)胞懸液接種于96孔板中，然后置37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入濃度梯度分別為：0.5，5.0，10.0，20.0，40.0，80.0 μmoI·L-1的化合物。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入濃度為5 g·L-1的噻唑藍(lán)(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT)20 μL，37 ℃孵育 4 h，棄去上清，加入150 μL 二甲亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)，震蕩10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)570 nm處溶液的吸光度。

1.7 細(xì)胞的攝取

MCF-7細(xì)胞用含10%胎牛血清 (Fetal Calf Serum，F(xiàn)BS) 的高糖 DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle Medium)培養(yǎng)基培養(yǎng)，按照密度 1×106cm-2接種于六孔板中，細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，加入濃度為2 mmol·L-1不同配合物溶液 150 μL，使 Gd（Ⅲ）的濃度為 100 μmol·L-1。37 ℃，5%CO2的條件培養(yǎng)16 h。

細(xì)胞用胰酶消化液(0.25%，含0.02%EDTA)消化，用1×PBS緩沖液洗滌2次，棄去上清，得細(xì)胞沉淀，加入高純濃硝酸40 μL室溫消解48 h，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的H2O240 μL室溫消解4 h，定容至1.5 mL，用ICP-MS檢測(cè)Gd（Ⅲ）的含量。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 紅外光譜分析

NCMCS、DTPA-NCMCS 及 Gd-(DTPA-NCMCS)的紅外光譜圖如圖1所示。對(duì)比NCMCS與DTPANCMCS的圖譜，大多數(shù)吸收峰基本相似；DTPANCMCS圖譜中1 734 cm-1出現(xiàn)了羧酸根中羰基的伸縮振動(dòng)峰，表明DTPA已被鍵合到NCMCS上。Gd-(DTPA-NCMCS)圖譜中 1 624 cm-1及 1 402 cm-1的吸收峰分別移到1 601 cm-1和1 384 cm-1處，說明DTPA-NCMCS與Gd（Ⅲ）形成了配位鍵。

圖1 原料NCMCS、配體DTPA-NCMCS及配合物Gd-(DTPA-NCMCS)的紅外光譜圖Fig.1 FTIR spectra of NCMCS,DTPA-NCMCS and Gd-(DTPA-NCMCS)

圖2為一組與CS相關(guān)的紅外譜圖，DTPA-CS圖譜中羧酸根中羰基的伸縮振動(dòng)峰在1 734 cm-1處，形成Gd-(DTPA-CS)配合物后，1 624 cm-1及1 402 cm-1的吸收峰分別移到1 594 cm-1和1 384 cm-1處。

圖2 原料CS、DTPA-CS及配合物Gd-(DTPA-CS)的紅外光譜圖Fig.2 FTIR spectra of CS,DTPA-CS and Gd-(DTPA-CS)

2.2 配合物中Gd（Ⅲ）含量的測(cè)定

用ICP-MS法測(cè)得配合物Gd-(DTPA-CS)中釓的含量達(dá)到22.38%，羧甲基殼聚糖配合物中配合物Gd-(DTPA-NCMCS)中釓的含量為12.83%。表明配合物Gd-(DTPA-NCMCS)中配體所占比例比配合物Gd-(DTPA-CS)中配體所占比例高，我們期望配合物分子量的增加會(huì)引起配合物縱向弛豫率的增加。

2.3 體外配合物穩(wěn)定性測(cè)定

草酸釓極難溶，被廣泛用于釓元素的萃取[16]。因此，我們將Na2C2O4與配合物Gd-(DTPA-NCMCS)、Gd-(DTPA-CS)和Gd-DTPA在37℃孵育24 h后用ICP-MS測(cè)定配合物 Gd-(DTPA-NCMCS)、Gd-(DTPACS)和Gd-DTPA中Gd（Ⅲ）的濃度，發(fā)現(xiàn)其比反應(yīng)前分別降低了(6.2±1.2)%，(6.8±1.8)%和(5.4±1.7)%。表明配合物Gd-(DTPA-NCMCS)在近生理?xiàng)l件下具有較大的穩(wěn)定性，可以進(jìn)一步用于體內(nèi)磁共振造影應(yīng)用。

2.4 體外馳豫性能

2.4.1 縱向弛豫率(r1)的測(cè)定

弛豫率用來(lái)評(píng)價(jià)不同造影劑的信號(hào)增強(qiáng)能力，順磁性造影劑的質(zhì)子弛豫性能通常通過縱向弛豫率r1來(lái)評(píng)價(jià)。配合物溶液的弛豫時(shí)間的倒數(shù)T1-1(s-1)與濃度(mmol·L-1)的線性關(guān)系如圖3所示，相關(guān)系數(shù)為0.999，表明兩者有很高的相關(guān)性。

圖3 配合物 Gd-(DTPA-NCMCS)、Gd-(DTPA-CS)及Gd-DTPA的T1-1與濃度之間的線性關(guān)系Fig.3 T1-1of Gd-(DTPA-NCMCS),Gd-(DTPA-CS)and Gd-DTPA vs the concentrations of the complexes

通過1.5.1中公式計(jì)算得到配合物Gd-(DTPANCMCS)、Gd-(DTPA-CS)和Gd-DTPA在水溶液中的縱向弛豫率r1，結(jié)果列于表1。從表中可以看出，Gd-(DTPA-NCMCS) 在水溶液中的 r1是 7.06 L·mmol-1·s-1Gd-(DTPA-CS)在水溶液中的 r1是 4.56 L·mmol-1·s-1，而 Gd-DTPA在水溶液中的 r1只有 3.01 L·mmol-1·s-1。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，配合物Gd-(DTPA-NCMCS)及Gd-(DTPA-CS)的r1值均高于商業(yè)化的MRI造影劑Gd-DTPA。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)[17-18]，引起弛豫率增加的原因一般有如下幾種：(a)其他結(jié)構(gòu)的引入增加了相對(duì)分子量，降低了分子的相關(guān)旋轉(zhuǎn)速率；(b)內(nèi)層配位水分子的增加；(c)外層配位水分子的增加。配合物弛豫率的提高主要是由第一種因素引起的，因?yàn)?COOH向-CONH-或-COO-的轉(zhuǎn)變一般不會(huì)引起內(nèi)層和外層水分子數(shù)目的變化。且配合物 Gd-(DTPA-NCMCS)和 Gd-(DTPA-NCMCS)的結(jié)構(gòu)相似，分子量大的Gd-(DTPA-NCMCS)縱向弛豫率r1更大。

表1 配合物Gd-(DTPA-NCMCS)、Gd-(DTPA-CS)及Gd-DTPA在水溶液中的縱向弛豫率r1Table 1 Longitudinal relaxation rate(r1)of Gd-(DTPA-NCMCS),Gd-(DTPA-CS)and Gd-DTPA in aqueous solution

2.4.2 體外T1加權(quán)成像

釓基功能配合物的體外T1加權(quán)成像效果通過不同濃度的圖像來(lái)表現(xiàn)。從圖中可以看出，隨配合物溶液濃度的增加，其體外成像的亮度逐漸增強(qiáng)。相同濃度下，Gd-(DTPA-NCMCS)與 Gd-(DTPA-CS)成像的亮度均大于Gd-DTPA，表明殼聚糖結(jié)構(gòu)的引入大大降低了分子的相關(guān)旋轉(zhuǎn)速率，提高了造影劑的弛豫率和成像信號(hào)強(qiáng)度。在濃度為2.0 mmol·L-1時(shí)，配合物Gd-(DTPA-NCMCS)成像亮度最強(qiáng)。換言之，要達(dá)到Gd-DTPA同等的成像亮度和對(duì)比度，使用配合物Gd-(DTPA-NCMCS)作為造影劑可以降低配合物用量，從而可提高其體內(nèi)安全性。

圖4 配合物 Gd-(DTPA-NCMCS)、Gd-(DTPA-CS)及 Gd-DTPA在不同濃度條件下體外T1加權(quán)成像圖Fig.4 T1-weighted images in vitro vs concentrations of Gd-(DTPA-NCMCS),Gd-(DTPA-CS)and Gd-DTPA

2.5 配合物的生物相容性

進(jìn)一步考察配合物的生物相容性，采用MTT法研究配合物對(duì)細(xì)胞的毒性。以HeLa細(xì)胞為作用對(duì)象。通過不同濃度的配合物作用于細(xì)胞，得到不同濃度下配合物對(duì)細(xì)胞的抑制率見表2，柱狀圖如圖5，擬合得到配合物Gd-(DTPA-CS)和Gd-(DTPANCMCS)的 IC50值(表)分別為 308.6 和 568.2 μmol·L-1。兩種配合物的IC50值均很大，表明這兩種配合物的毒性很低，可以作為潛在的磁共振造影劑。

圖5 配合物 Gd-(DTPA-CS)和 Gd-(DTPA-NCMCS)對(duì)HeLa細(xì)胞的毒活性(48 h)Fig.5 Cytotoxicity against HeLa cells of Gd-(DTPANCMCS)determined by MTT assay after 48 h

表2 配合物Gd-(DTPA-CS)和Gd-(DTPA-NCMCS)對(duì)HeLa細(xì)胞作用的IC50值Table 2 IC50against HeLa cells of Gd-(DTPA-CS)and Gd-(DTPA-NCMCS)

本實(shí)驗(yàn)用ICP-MS測(cè)定了HeLa細(xì)胞中Gd的含量(表3)，結(jié)果說明修飾了殼聚糖和N-羧甲基殼聚糖的Gd-DTPA配合物進(jìn)入細(xì)胞的量均比Gd-DTPA進(jìn)入細(xì)胞的量多，尤其是Gd-(DTPA-NCMCS)進(jìn)入細(xì)胞的量最多，達(dá)到 17.8 μg·L-1。 結(jié)果表明，達(dá)到相同的造影效果，配合物Gd-(DTPA-NCMCS)的使用量最低，從而可減少造影劑的毒性。

表3 用ICP-MS測(cè)定的HeLa細(xì)胞中的Gd含量Table 3 Cellular uptake of Gd-(DTPA-NCMCS),Gd-(DTPA-CS)and Gd-DTPA by HeLa cells in terms of Gd content determined by ICP-MS

3 結(jié) 論

綜上所述，本研究選擇具有優(yōu)良性能的N-羧甲基殼聚糖修飾DTPA，合成了配合物Gd-(DTPANCMCS)。該化合物具有以下優(yōu)良性能：(1)在生理?xiàng)l件下具有良好的穩(wěn)定性；(2)高弛豫性能，Gd-(DTPA-NCMCS)在水溶液中的r1高于臨床造影劑Gd-DTPA，且高于Gd-(DTPA-CS)。較高的弛豫率表明在較低的釓量下可以達(dá)到同等的MRI對(duì)比增強(qiáng)效果，從而可降低金屬離子在體內(nèi)引發(fā)的毒性；(3)Gd-(DTPA-NCMCS)的低毒性和較高的細(xì)胞攝取率表明配合物Gd-(DTPA-NCMCS)有望成為性能優(yōu)良的新型MRI造影劑。

[1]Shellock F G,Kanal E.J.Magn.Reson.Imaging,1999,10:477-84

[2]Mathur-de Vr′e R,Lemort M.Br.J.Radiol.,1995,68:225-247

[3]HeWJ,GuoZJ.Comprehensive Inorganic ChemistryⅡ:From Elements to Applications.Amsterdam:Elesevier,2013:733-780

[4]Terreno E,Castelli D D,Viale A,et al.Chem.Rev.,2010,110:3019-3042

[5]Viswanathan S,Kovacs Z,Green K N,et al.Chem.Rev.,2010,110:2960-3018

[6]Bellin M F.Eur.J.Radiol.,2006,60:314-323

[7]Wiener E,Brechbiel M W,Brothers H,et al.Magn.Reson.Med.,1994,31:1-8

[8]Tang J B,Sheng Y Q,Hu H J,et al.Prog.Polym.Sci.,2013,38(3/4):462-502

[9]LIU Ai-Yan(劉愛燕),DING Chen(丁晨),ZHANG Xiao-Yan(張小燕),et al.Fine Chemicals(精細(xì)化工),2012,29(5):429-433

[10]Sherry A D,Brown R D,Geraldes C F,et al.Inorg.Chem.,1989,28:620-622

[11]Ortona O,Errico G D,Mangiapia G,et al.Carbohydr.Polym.,2008,74:16-22

[12]Eckelman W C,Karesh S M,Reba R C,et al.J.Pharm.Sci.,1975,64:704-706

[13]Nagib S,Inoue K,Yamaguchi T,et al.Hydrometallurgy,1999,51:73-85

[14]Weinmann H J,Brasch R C,Press W R,et al.Am.J.Roentgenol.,1984,142:619-624

[15]Cacher W P,Nickle S K,Sherry A D.Inorg.Chem.,1987,26:958-960

[16]JIAO Cheng-Min(焦程敏),LU Wen-Qing(盧文慶),CHENG Qing(程青),et al.Chinese J.Inorg.Chem.(無(wú)機(jī)化學(xué)學(xué)報(bào)),2006,22(1):166-170

[17]Lebduskova P,Kotek J,Hermann P,et al.Bioconjugate Chem.,2004,15(4):881-889

[18]YU Kai-Chao(俞開潮),WAN Fu-Xian(萬(wàn)福賢),ZHANG Yan(張焱),et al.Chinese J.Inorg.Chem.(無(wú)機(jī)化學(xué)學(xué)報(bào)),2004,20(4):389-393