利用德氏乳桿菌全酶液水解牛乳酪蛋白

張咚咚，安家彥，姜鐵民，劉繼超，陳歷俊,*

（1.大連工業大學生物工程學院，遼寧 大連 116034；2.北京三元食品股份有限公司，北京 100076）

利用德氏乳桿菌全酶液水解牛乳酪蛋白

張咚咚1,2，安家彥1，姜鐵民2，劉繼超2，陳歷俊1,2,*

（1.大連工業大學生物工程學院，遼寧 大連 116034；2.北京三元食品股份有限公司，北京 100076）

采用響應面法優化超聲破碎工藝獲取乳酸菌的全酶液，探討超聲破碎功率、超聲破碎時間以及溶菌酶的添加量對超聲破碎的影響，對獲取的全酶液進行水解脫脂乳及酪蛋白的實驗。結果表明：隨著超聲破碎功率的加大，超聲破碎時間的增加，所得酶活力值均呈現先增長后下降的趨勢，分析所得的回歸方程確定最佳工藝修正參數為：超聲破碎儀設定功率71%，超聲破碎儀設定時間7.5 min，體系中溶菌酶的添加量290 μL/30 mL菌液。在此條件下獲取的全酶液水解脫脂乳及酪蛋白顯示，超聲破碎的過程對酶活力有較大損失，分開處理其胞內和胞外酶液，水解脫脂乳和酪蛋白所獲得游離氨基氮的含量分別提高了223.86%和324.11%，高效液相色譜分析結果也證明全酶液水解所得多肽含量及肽段大小多樣性均有所提高。

德氏乳桿菌；全酶液；水解；牛乳；酪蛋白

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一大類利用碳水化合物發酵過程中產生乳酸的細菌的總稱，廣泛存在于人體腸道中，是人體必不可少的益生菌[1]，乳酸菌還含有豐富的蛋白水解酶系[2]，在應用上的安全性及其所具有復雜的蛋白酶系是其在食品應用上較多的主要原因之一，在乳制品發酵中可產生豐富的風味類物質[3]，對水解牛奶中的酪蛋白產生乳清蛋白及多肽[4]，促進消化吸收以及潛在的醫藥應用上，有較大的應用價值。

本實驗利用超聲破碎菌體獲得胞內酶系，并以胞內主要的亮氨酸氨肽酶[4]活力作為響應值做響應面優化工藝研究，而后將胞內和胞外酶系共同作用于12 g/100 mL脫脂乳和1 g/100 mL酪蛋白，檢測其蛋白水解能力，并進行高效液相色譜檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

LB2菌株，前期篩選高產蛋白酶乳酸菌所得，保存于北京三元食品股份有限公司技術中心，鑒定為德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）。

1.1.2 試劑與培養基

脫脂乳粉 新西蘭西部乳業有限公司；L-亮氨酸-4-硝基苯胺（L-leucine-4-nitroanilide，LNA） 阿法埃莎（天津）化學有限公司；對硝基苯胺 阿拉丁試劑（中國）有限公司；酪蛋白（由牛奶中提取） 北京奧博星生物技術有限責任公司；厭氧盒及厭氧袋 日本三菱瓦斯化學株式會社；溶菌酶 北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為分析純。

De Man、Rogosa and Sharpe（MRS）培養基和MRS肉湯培養基 北京路橋技術有限責任公司。

1.2 儀器與設備

AC2-4S1二級生物安全柜 美國ESCO公司；Cintra 20雙光束紫外-可見分光光度計 澳大利亞GBC公司；3K-15高速冷凍離心機 德國Sigma公司；Polystat K6-1循環式精密恒溫水浴鍋 德國Huber公司；VCX400超聲破碎儀 美國Sonics公司；LC10A vp高效液相色譜日本Shimadzu公司。

1.3 方法

1.3.1 用于超聲破碎菌液的制備

將活化好的乳酸菌接入發酵瓶，厭氧37℃培養18～24 h，制成種子液。制備好的種子液按3%的接種量接種于新鮮MRS肉湯培養基中，厭氧37℃培養48 h，考慮到超聲破碎本身與培養基的相互影響，所以離心去掉培養基取菌體，用pH 8.0的Tris-HCl緩沖液重懸，洗滌菌體2～3遍[5]，重懸于Tris-HCl緩沖溶液中，調整其菌懸液OD600nm為一固定值，4 ℃放置備用[7]。

1.3.2 氨肽酶活力的測定

將超聲破碎處理后的菌液稀釋數倍，取0.4 mL加入6 mL pH8.0的Tris-HCl緩沖液中，于40 ℃水浴預熱5 min，加入0.4 mL 26 mmol/L的LNA乙醇溶液（對照中加超純水），準確反應30 min后，立即放入冰水浴中，5 min后測定其吸光度A405nm。酶活力定義：在40 ℃、pH 8.0條件下，每分鐘水解生成1 μg對硝基苯胺所需要的酶量定義為一個酶活力單位，以U/mL表示[8]。氨肽酶活力按照下式計算。

式中：K為消光系數，本實驗中K=0.073 5；6.8為反應的總體積/mL；30為恒溫反應時間/min；0.4為酶液體積/mL；D為稀釋倍數；ΔA405nm為樣品組吸光度與對照組吸光度的差值。

1.3.3 標準曲線的繪制

配制一系列梯度質量濃度的對硝基苯胺標準溶液，以去離子水做對照，分別測定其吸光度A405nm。以吸光度為縱坐標，不同對硝基苯胺質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，獲得回歸方程：y=0.073 5x－0.001 6（R2=0.999 5）。

1.3.4 單因素試驗

1.3.4.1 超聲功率

取菌液30 mL，設置超聲破碎儀的時間為9 min，超聲3 s、間隔4 s、超聲探頭溫度4 ℃，分別設定超聲功率為50%、60%、70%、80%、90%，由于所用超聲破碎儀的總功率為400 W，設定功率分別對應為200、240、280、320、360 W。冰水浴超聲。

1.3.4.2 超聲時間

取菌液30 mL、超聲3 s、間隔4 s、探頭溫度4 ℃，以1.3.4.1節所得最佳超聲功率為設定功率，設定超聲破碎儀的超聲時間分別為5、7、9、11、13 min，設定超聲時間所對應的超聲破碎的總時間分別為11.67、16.33、21.00、25.67、30.33 min。冰水浴超聲。

1.3.4.3 溶菌酶添加量

取4個50 mL離心管，分別取菌液30 mL，依次加入溶菌酶100、200、300、400 μL，混勻后在37 ℃水浴中反應1 h，反應結束后放入4 ℃冰箱。設定超聲3 s、間隔4 s、探頭溫度4 ℃，以最佳超聲功率、最佳超聲時間，分別對不同溶菌酶加量的菌液超聲破碎，超聲過程菌液冰水浴。

1.3.5 響應面優化分析的試驗設計

綜合單因素試驗結果，結合Box-Behnken的中心組合試驗設計原理，采用響應面分析法對超聲破碎功率、時間和溶菌酶加量做三因素三水平中心點重復5次的試驗方案。

1.3.6 利用超聲破碎獲得全酶液水解脫脂乳和酪蛋白

為避免超聲破碎過程中對不需要破碎的發酵液的影響，特別將發酵液與菌體離心分開做對照，一組為直接超聲破碎發酵液連帶菌體得所需全酶液；另一組將離心所得菌體加入等發酵液體積的pH 7.5磷酸緩沖液中，超聲破碎完成后再與發酵液等體積混合，得所需全酶液，在計算水解能力時考慮稀釋倍數因素。

取1 mL粗酶液分別加入到2 mL 12 g/100 mL脫脂乳和1 g/100 mL酪蛋白溶液中，37 ℃孵育30 min，加入等體積的24 g/100 mL的三氯乙酸溶液終止反應，室溫下靜置30 min，3 000×g離心30 min，然后用Whatman 2#濾紙過濾，將濾液保存于－20 ℃冰箱，待用。以先加24 g/100 mL的三氯乙酸和粗酶液37 ℃孵育30 min使酶活力被充分破壞，再加入12 g/100 mL脫脂乳和1 g/100 mL酪蛋白溶液為對照樣，作同樣條件的處理。定義全酶系水解蛋白的水解程度為100%，以其他各實驗組游離氨基氮占全酶系水解組的百分比來表示其蛋白水解能力。

1.3.7 蛋白水解氨基氮的測定

采用鄰苯二甲醛法測定水解度[6]。鄰苯二甲醛試劑的配制：準確稱取0.040 g鄰苯二甲醛溶解于1 mL甲醇溶液中，稱取0.950 g四硼酸鈉（Na2B4O7·10H2O），0.5 g十二烷基磺酸鈉，加入100 μL β-巰基乙醇，溶解后定容至50 mL，現配現用。

取100 μL濾液，加入2 mL現配的鄰苯二甲醛試劑，室溫條件下精確反應2 min，測定340 nm波長處的吸光度。

1.3.8 氨基酸標準曲線的制作

配制1 mg/mL的亮氨酸溶液，依次稀釋為50、100、200、300、400、500 μg/mL的標準溶液系列，按照1.3.7節測定吸光度，制作標準曲線，按照式（2）計算樣品中的游離氨基氮的含量。

式中：ρ為樣品中游離氨基氮的含量/（μg/mL）；A為根據濾液的吸光度，通過標準曲線計算出的游離氨基氮的質量濃度/（μg/mL）；n為稀釋因子。

1.3.9 酶水解液的高效液相色譜檢測

對酶水解液過0.22 μm濾膜，按以下條件進行反相色譜分析[7-11]：色譜柱：Agela Venusil ASB C18（250 mm×4.6 mm，孔徑150 ?，5 μm粒徑）；柱溫：25 ℃；流速：0.8 mL/min；檢測波長：214 nm；進樣量：10 μL；梯度混合程序如表1所示。流動相A：0.1%三氟乙酸水溶液，流動相B：0.1%三氟乙酸乙腈溶液。

表1 RP-HPLC 分析的流動相梯度表Table 1 Gradient conditions of the mobile phase for RP-HPLC analysis

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 超聲破碎功率對體系中氨肽酶活力的影響

選取不同超聲破碎功率進行破碎，由圖1可以看出，當破碎功率設定為70%，即所用功率為280 W時超聲破碎效果最好，隨著功率的增大，其酶活力急劇下降，這可能與超聲過程中產熱較快，傳導較慢，引起酶結構改變[12]，造成酶失活有關，有關文獻認為，由于蛋白分子中含有較多的半胱氨酸，超聲破碎后產生的自由基會導致蛋白分子間形成二硫鍵，改變蛋白本身的結構，引起酶結構的改變，從而引起酶活力的下降[13-14]。另外氣液界面的剪切效應也是引起酶活力下降的主要因素，Oliva等[15]發現促使蛋白變性的原因主要是蛋白的自身性質和剪切時的氣液界面，在超聲破碎過程中不可避免的氣泡產生，氣液面所產生剪切力也是引起蛋白變性及酶失活的原因之一。

圖1 超聲破碎功率對體系中氨肽酶活力的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on aminopeptidase activity in the fermentation broth

2.1.2 超聲破碎時間對體系中氨肽酶活力的影響

圖2 超聲破碎時間對體系中氨肽酶活力的影響Fig.2 Effect of ultrasonic irradiation time on aminopeptidase activity in the fermentation broth

不同的超聲破碎時間下，由圖2可以看出，在超聲破碎設定時間7 min時獲得較高的酶活力，在5 min時可能是超聲破碎不完全，而隨著超聲時間的延長其酶活力在緩慢降低。一般認為在超聲破碎過程中，超聲波形成的空穴效應及復合伴隨形成的瞬時高溫高壓的變化，都會破壞蛋白結構使酶失活。雖然在實驗過程中利用冰水浴使超聲破碎樣品始終處于較低的溫度，但是在空穴氣泡破碎的瞬間產生的局部高溫高壓也可能會引起蛋白結構的破壞和酶的失活[13]。

2.1.3 溶菌酶添加量對體系中氨肽酶活力的影響

圖3 溶菌酶添加量對體系中氨肽酶活力的影響Fig.3 Effects of lysozyme dose on aminopeptidase activity in the fermentation broth

溶菌酶是一種專門作用于微生物細胞壁的水解酶，能有效地水解細菌細胞壁的肽聚糖，而不影響細胞的其他組織，且本身無毒無害，是一種天然安全的殺菌劑、防腐劑[14]。

由于本實驗采用的德氏乳桿菌保加利亞亞種，有較厚的細胞壁，添加溶菌酶能有效提升細胞的破壁效率。由圖3可以看出，在每30 mL菌液中添加量為300 μL時其酶活力較好。

2.2 響應面優化試驗

2.2.1 響應面試驗設計及其結果分析

根據Box-Behnken的中心組合設計原理，利用Design-Expert.V8.0.6.1軟件進行Box-Behnken試驗設計，試驗方案及結果見表2。

表2 響應面分析試驗及結果Table 2 Response surface design matrix and experimental results

2.2.2 擬合模型的建立

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression model

采用Design Expert 8.0.6軟件對表2中的實驗數據進行多元回歸擬合，獲得回歸方程：R=3.13＋0.043A＋0.18B－0.21C＋0.35AB＋0.11AC＋0.28BC－0.66A2－0.29B2－0.51C2。

式中采用的是模擬值，R為響應值氨肽酶活力。

從表3可以看出，響應面的回歸模型F檢驗很顯著（P＜0.05），相關系數R2=0.992 6，表明99%的數據可以依據這個模型來解釋，失擬項的F值為0.25，P值為0.860 7＞0.05，不顯著，說明回歸模型失擬不顯著，實驗誤差較小。分析表明可以用回歸方程模型代替試驗點對實驗結果分析。影響酶活力值的因素超聲破碎時間（B）和溶菌酶添加量（C）的P值均小于0.01，說明其影響極為顯著，超聲破碎功率（A）的一次項不顯著，說明試驗響應值的變化非常復雜，各個試驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系，而存在二次關系，且三因素間存在明顯的交互作用。影響響應值R的因素主次順序為C＞B＞A，即是溶菌酶添加量＞超聲破碎時間＞超聲破碎功率。

2.2.3 響應面分析

圖4 超聲破碎功率、時間和溶菌酶添加量對氨肽酶活力影響的響應面和等高線Fig.4 Response surface and contour plots showing the interactive effects of ultrasonic irradiation time, power and lysozyme dose on aminopeptidase activity in the fermentation broth

通過模型方程所得的響應曲面圖和等高線圖如圖4所示。通過Design Expert軟件分析所得到的最佳數據組合為：超聲破碎儀設定功率71.1%、設定時間7.6 min、溶菌酶添加量289 μL，模型預測的氨肽酶活力值為3.17 U/mL。在實際操作過程中，選取條件為超聲破碎儀設定功率為71%、設定時間為7.5 min，溶菌酶添加量為290 μL/30 mL菌液，做3次平行實驗所得酶活力值的平均值為3.13 U/mL，與理論預測值基本相符，說明該回歸方程較為合理。

2.2.4 酶液水解12 g/100 mL脫脂乳和1 g/100 mL酪蛋白的氨基氮含量

根據亮氨酸溶液制作的氨基酸標準曲線獲得回歸曲線方程為y=0.002 2x＋0.022 9，R2為0.998 9，相關較強。如圖5、6所示，在超聲破碎所得胞內酶系的共同作用下其水解底物能力的顯著增強，脫脂乳和酪蛋白體系的游離氨基氮質量濃度分別由651.41、454.14 μg/mL增加到2 109.70、1 926.05 μg/mL；在發酵液連帶菌體的情況下直接進行細胞的超聲破碎，其水解底物的能力僅有部分的增強，體系游離氨基氮的含量僅分別增加到858.69 μg/mL和785.56 μg/mL。一方面胞內蛋白水解酶系的釋放，會增加總的蛋白水解能力，但是由于超聲破碎過程中，對原來釋放到發酵液中的胞外蛋白水解酶系的破壞，使其蛋白水解能力有部分抵消，不能顯著增強其蛋白水解能力。在將發酵液中釋放的胞外蛋白酶系低溫離心外部存放后，不會對其造成過多的破壞，然后再將菌體重懸于低溫磷酸緩沖液中，進行超聲破碎獲取胞內的蛋白水解酶系，這樣的方式，不但能夠最大限度的保留胞外蛋白酶系，也能最大限度地獲取胞內的蛋白水解酶系。另一方面，由于乳酸菌的發酵產酸特性，發酵液中的pH值呈酸性，可能會對胞內蛋白酶系產生部分破壞，加入的磷酸緩沖液會減弱此破壞作用，使大部分蛋白水解酶發揮較大的水解能力。在超聲破碎過程中，緩沖液的黏度要比發酵液的黏度小，同等超聲破碎條件下，可能會有更充分的超聲破碎效果[17]。

圖5 粗酶液與12 g/100 mL脫脂乳反應體系中游離氨基氮的含量及水解度Fig.5 Free amino nitrogen content and degree of hydrolysis in the reaction system of 12 g/100 mL skim milk and crude enzymes from Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus

圖6 粗酶液與1 g/100 mL酪蛋白反應體系中游離氨基氮的含量及相對水解度Fig.6 Free amino nitrogen content and degree of hydrolysis in the reaction system of crude enzymes from Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and 1 g/100 mL casein

2.2.5 酶水解液的高效液相色譜檢測

經過高效液相色譜后，水解液中的多個多肽組分被較為清晰地分開，在實驗中并沒有具體確定各多肽的具體成分，僅希望通過分析能較為直觀的證明乳酸菌的全酶在水解酪蛋白后產生的多肽更具有多樣性，為之后進一步研究其營養價值提供依據[18-19]。

圖7 全酶液與胞外酶液水解12 g/100 mL脫脂乳的高效液相色譜圖Fig.7 Comparative chromatograms of 12 g/100 mL skim milk hydrolysates by holoenzyme and extracellular enzyme

如圖7所示，全酶液水解色譜圖中各峰面積較胞外酶液水解組有一定的增加，尤其是27.82 min處峰值增加較為明顯，增幅42.63%；41.78 min處峰面積增幅達216.95%，說明此處多肽含量有明顯的增加；在42.76 min左右的兩個色譜峰變化更為明顯，左側峰的明顯加大及右側峰的明顯降低，說明多肽成分及含量的顯著變化，說明在不同酶系水解過程中的相似性及差異性。

圖8 全酶液與胞外酶液水解1 g/100 mL酪蛋白的高效液相色譜圖Fig.8 Comparative chromatograms of 1 g/100 mL casein hydrolysates by holoenzyme and extracellular enzyme

圖8 是全酶液和胞外酶液水解1 g/100 mL酪蛋白的水解液色譜分析圖，全酶液組各色譜峰面積的顯著增大，尤其是38.86 min處的峰面積增加了24.32%，77.80 min處的峰面積更是增加了233.83%，表明各多肽含量的增加明顯；色譜峰數也有較多的增加，25～29 min出現較多小峰，34、37 min左右、42 min，66～68 min，以及后面洗脫峰的較多出現，都表明有較多新的肽段的出現，表明全酶的水解過程中酶系水解的復雜性及多樣性。多肽是目前被研究較多的物質，不但在促進消化吸收上面，而且在其他的一些藥用上面有較廣泛的價值，全酶的水解應用，不但直接促進蛋白的消化吸收，還有潛在的藥用醫用價值。

3 結 論

在對乳酸菌全酶系的應用上，本研究采用超聲破碎技術，通過響應面優化超聲破碎獲得胞內酶系。確定體系的最佳超聲破碎參數組合為超聲破碎儀設定功率為71%、設定時間為7.5 min，溶菌酶添加量為290 μL/30mL菌液，獲得最大亮氨酸氨肽酶活力值為3.13U/mL，將此條件下所獲得胞內酶系和胞外酶系結合應用到水解脫脂乳及純酪蛋白上。

在全酶系水解酪蛋白的應用上，盡量排除超聲破碎過程中對酶活力的影響，采用菌體菌液分開超聲破碎而后再合并的方法，對水解效果有較大的提升，脫脂乳水解過程中體系中水解產生的游離氨基氮含量從僅胞外酶的651.41 μg/mL提升到分開超聲破碎時的2 109.70 μg/mL，提升223.86%；牛奶中酪蛋白水解體系中從454.14 μg/mL提升到1 926.05 μg/mL，提升324.11%，水解能力顯著增加，這可能和乳酸菌內含有復雜的蛋白水解酶系有關[20]。高效液相色譜分析也表明，全酶系的應用不僅僅是在多肽含量上有增加，而且對多肽大小的多樣性上也有較多增加，尤其是在酪蛋白的水解上。這些對促進牛奶中大分子酪蛋白的消化吸收[21]，以及對多肽對人體生理方面的影響及其他方面進一步研究都有較大的參考價值。

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Hydrolysis of Milk Casein with Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Holoenzyme

ZHANG Dong-dong1,2, AN Jia-yan1, JIANG Tie-min2, LIU Ji-chao2, CHEN Li-jun1,2,*
(1. School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China; 2. Beijing Sanyuan Foods Co. Ltd., Beijing 100076, China)

Response surface methodology (RSM) was employed to optimize ultrasonic power, irradiation time and lysozyme dose for the release of holoenzyme from Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Experiments were conducted to investigate the hydrolysis of skim milk and casein with the holoenzyme. Results indicated that the enzyme activity rose at first and then declined with increasing ultrasonic power and extended irradiation time. From the proposed regression model, the optimal conditions for holoenzyme release were determined as ultrasonication for 7.5 min at a power of 71% and hydrolysis with lysozyme at a dose of 290 μL/30 mL of cell suspension. The whole fermentation broth of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus was treated under these conditions to obtain holoenzyme 1 or centrifugally separated into cells and supernatant. The cells were individually treated under the same conditions and combined with the supernatant to obtain holoenzyme 2. The content of free amino nitrogen in hydrolyates of skim milk and casein by holoenzyme 2 was increased by 223.86% and 324.11%, respectively, when compared with holoenzyme 1. This may be attributed to losses of extracellular enzyme activities caused by ultasonication. HPLC analysis showed that polypeptides with diverse molecular weight distribution were generated in higher amounts by using the whole enzymes than extracellular enzymes alone.

Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus; holoenzyme; hydrolysis; milk; casein

TS252.1

A

1002-6630（2014）07-0107-06

10.7506/spkx1002-6630-201407022

2013-04-19

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2013BAD18B04）

張咚咚（1988—），男，碩士研究生，研究方向為食品微生物及其應用。E-mail：medong@126.com

*通信作者：陳歷俊（1967—），男，高級工程師，博士，研究方向為乳品加工。E-mail：chlj@263.net