月桂酰氯修飾羊血超氧化物歧化酶工藝優(yōu)化及酶學(xué)性質(zhì)

楊學(xué)山，王本啟，王正娟，楊佐青，李遠(yuǎn)玲，康延良

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

月桂酰氯修飾羊血超氧化物歧化酶工藝優(yōu)化及酶學(xué)性質(zhì)

楊學(xué)山，王本啟，王正娟，楊佐青，李遠(yuǎn)玲，康延良

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

以羊血為材料獲得超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）酶液，采用月桂酰氯修飾SOD，在修飾溫度、修飾時間、月桂酰氯添加量和丙酮添加量的單因素試驗基礎(chǔ)上，通過正交試驗優(yōu)化工藝參數(shù)，并比較修飾酶與天然酶的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明：10 mL酶比活力為4 348.6 U/mg的SOD樣液在修飾溫度60 ℃、修飾時間30 min、月桂酰氯用量0.1 mL、丙酮添加量為酶液體積的1.5倍條件下充分反應(yīng)，所得修飾酶活力最強；修飾酶熱穩(wěn)定性、pH值耐受性、半衰期等均優(yōu)于天然酶。月桂酰氯可用于修飾性能較優(yōu)的羊血超氧化物歧化酶。

羊血SOD；月桂酰氯；修飾；酶活力

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是需氧生物體內(nèi)唯一的超氧陰離子自由基清除劑，在抗炎、抗衰老及防輻射等方面有廣泛的用途[1-2]。迄今為止人們已從細(xì)菌、真菌、原生動物、藻類、昆蟲、魚類、植物和哺乳動物等生物體內(nèi)分離到SOD，不同生物體內(nèi)SOD含量和活性各不相同，其中以哺乳動物血液中含量和活性最高[3]。甘肅省是是全國五大牧區(qū)之一，具有豐富的羊血資源，可作為開發(fā)SOD的絕佳原料[4]。SOD可廣泛應(yīng)用于食品、美容、保健和醫(yī)藥等行業(yè)[5-6]，但在實際應(yīng)用過程中，存在體外穩(wěn)定性差、半衰期短、口服時易受胃蛋白酶分解等缺點[7-9]，限制了SOD相關(guān)產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)。

化學(xué)修飾是提高酶分子穩(wěn)定性的有效方法之一，脂肪酸[10]、低分子肝素[11]、右旋糖酐[12]、牛血清白蛋白[13]、聚乙二醇[14]等修飾劑都曾用于豬血、牛血來源SOD的化學(xué)修飾，取得了較為滿意的結(jié)果，但對羊血SOD的化學(xué)修飾，國內(nèi)外尚未見報道。月桂酰氯是月桂酸的活化分子，在弱堿性條件下可與SOD分子表面非活性部位的賴氨酸殘基共價結(jié)合，形成酰化SOD[15]。酰化所產(chǎn)生的空間障礙和靜電斥力阻礙了蛋白水解酶和其他抑制劑對SOD活性部位的攻擊，使SOD穩(wěn)定性提高[16]。本研究擬利用新鮮羊血，采用月桂酰氯對分離純化的天然SOD進(jìn)行修飾，并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，以期建立較為高效的修飾方法，為促進(jìn)羊血SOD深度開發(fā)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮羊血采自蘭州小西湖屠宰場。

牛血清白蛋白 美國Pharmacia公司；月桂酰氯（純度度≥98%，分子質(zhì)量218.77 D） 上海諾泰化工有限公司；TritonX-100、CuSO4、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、EDTA、鄰苯三酚、丙酮、氯仿、乙醇、檸檬酸鈉等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SL-1001電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；TGL-166臺式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；PHS-3C pH計 上海雷磁有限公司；TU1800型紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 羊血SOD提取工藝流程

以本實驗室建立的分離提取工藝進(jìn)行羊血SOD分離純化[17]，工藝流程如下：

新鮮羊血→預(yù)處理→收集紅血球→溶血→去除血紅蛋白→丙酮沉淀→磷酸鹽緩沖液溶解→熱變性處理→透析→DEAE-Sephadex A-50柱層析→真空冷凍干燥→酶比活力測定

其中蛋白含量測定采用考馬斯亮藍(lán)法[18]，SOD活性采用鄰苯三酚法測定[19]。酶活力單位（U）定義為：在25 ℃時，1 mL反應(yīng)液中1 min抑制鄰苯三酚自氧化速率達(dá)50%的酶量定義為1個酶活力單位。酶比活力（U/mg）是指每毫克SOD蛋白所具備的酶活力。

1.3.2 SOD化學(xué)修飾工藝流程

SOD樣液→加月桂酰氯（1 mol/L NaOH維持pH 9.0）→攪拌→丙酮沉淀→抽濾、洗滌→酶比活力測定

1.3.3 單因素試驗設(shè)計

分別對不同修飾溫度、修飾時間、月桂酰氯添加量和丙酮添加量進(jìn)行單因素試驗，重復(fù)3次。以修飾酶比活力為指標(biāo)，為正交試驗選擇因素水平。

1.3.3.1 修飾溫度對修飾SOD比活力的影響

取5組10 mL SOD酶液，各加月桂酰氯0.1 mL，分別置于40、45、50、55、60 ℃條件下，水浴振蕩60 min（滴加1 mol/L NaOH維持pH 9.0），再加入1.5倍體積冷丙酮，4 000 r/min離心15 min。計算修飾酶比活力。

1.3.3.2 修飾時間對修飾SOD比活力的影響

取5組10 mL SOD酶液，各加月桂酰氯0.1 mL，55 ℃水浴振蕩15、30、45、60、75 min（滴加1 mol/L NaOH維持pH 9.0），再加入1.5倍體積冷丙酮，4 000 r/min離心15 min。計算修飾酶比活力。

1.3.3.3 月桂酰氯添加量對修飾SOD比活力的影響

取5組10 mL SOD酶液，分別加入0.075、0.100、0.125、0.150、0.175 mL月桂酰氯，55 ℃水浴振蕩30 min（滴加1 mol/L NaOH維持pH 9.0），再加入1.5倍體積冷丙酮，4 000 r/min離心15 min。計算修飾酶比活力。

1.3.3.4 丙酮添加量對修飾后SOD比活力的影響

取5組10 mL SOD酶液，加入0.1 mL月桂酰氯，55 ℃水浴振蕩30 min（滴加1 mol/L NaOH維持pH 9.0），分別加入酶液體積0.75、1.00、1.25、1.50、1.75倍冷丙酮，4 000 r/min離心15 min。計算修飾酶比活力。

1.3.4 正交試驗優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果確定因素和水平，采用四因素三水平L9（34）正交試驗設(shè)計，計算月桂酰氯修飾SOD每一試驗組合的酶比活力，重復(fù)3次。結(jié)果進(jìn)行直觀分析得到最優(yōu)組合，通過對最優(yōu)組合條件進(jìn)行驗證實驗，確定月桂酰氯修飾SOD的最優(yōu)工藝。

1.3.5 修飾酶與天然酶穩(wěn)定性比較

1.3.5.1 溫度穩(wěn)定性

取天然酶和修飾酶各5組，分別在55、65、75、85、95 ℃條件下處理30 min，測定天然酶和修飾酶的相對酶活力（以起始酶活力為100%計）。重復(fù)3次。

1.3.5.2 pH值穩(wěn)定性

分別配制pH值為3、5、7、9、11的Tris-HCl緩沖液，取天然酶和修飾酶各5組，每組加入上述不同pH值溶液，室溫靜置1 h，測定其相對酶活力(以起始酶活力為100%計)，比較修飾酶和天然酶的pH值穩(wěn)定性。重復(fù)3次。

1.3.5.3 半衰期測定

將同批次制備的天然酶和液態(tài)修飾酶貯于4 ℃，每隔4 d測其酶活力變化，重復(fù)3次。分別以第1天與第5天、第5天與第9天所得酶活力值代入下式計算半衰期[20]。

式中：t1/2為半衰期/d（即修飾酶活力下降為最初活力一半時所經(jīng)歷的連續(xù)工作時間）；E0為原始酶活力/（U/ mL）；t為時間/d；E為t時的酶活力/（U/ mL）。最后將所得t1/2求平均值，計算得修飾酶和天然酶的半衰期。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊血SOD分離純化

根據(jù)1.3.1節(jié)的方法，獲得羊血SOD提取液酶活力為861.1 U/ mL，蛋白含量為0.198 mg/mL，經(jīng)計算酶比活力為4 348.6 U/mg。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 修飾溫度對修飾SOD比活力的影響結(jié)果

圖1 修飾溫度對SOD比活力的影響Fig.1 Effect of modification temperature on SOD specific activity

由圖1可知，修飾溫度為55 ℃時SOD比活力最高，修飾效果最好，且和40、45、50、60 ℃之間在5%水平上差異顯著。45、50、60 ℃之間在5%水平上差異不顯著性，所以選擇55 ℃為SOD修飾的反應(yīng)溫度。SOD屬于蛋白質(zhì)，溫度較低時蛋白質(zhì)殘基與修飾劑的耦合不充分，溫度較高時修飾劑與氨基酸殘基耦合過多均導(dǎo)致酶比活力下降。

2.2.2 修飾時間對修飾SOD比活力的影響結(jié)果

圖2 修飾時間對SOD比活力的影響Fig.2 Effect of modification time on SOD specific activity

由圖2可知，修飾時間在15、60、75 min時差異不顯著；修飾時間30 min時所得到的SOD酶比活力最高，且與15、45、60、75 min之間在5%水平上有顯著性差異，所以應(yīng)選擇30 min為較佳修飾時間。當(dāng)溫度一定時，較短的修飾時間，月桂酰氯與SOD氨基酸殘基耦合不充分，而時間過長可能會導(dǎo)致月桂酰氯與SOD活性中心氨基酸殘基耦合導(dǎo)致SOD比活力下降。

2.2.3 月桂酰氯添加量對修飾SOD比活力的影響結(jié)果

圖3 月桂酰氯添加量對SOD比活力的影響Fig.3 Effect of lauroyl chloride dosage on SOD specific activity

由圖3可知，當(dāng)10 mL酶液中月桂酰氯用量為0.100 mL時，修飾后的SOD酶比活力最高，且和月桂酰氯的用量為0.075、0.125、0.150、0.175 mL之間在5%水平上差異顯著，而月桂酰氯的用量為0.075、0.125、0.150、0.175 mL之間在5%水平上差異不顯著。月桂酰氯作為SOD的修飾劑，用量過少會造成月桂酰氯與SOD氨基酸殘基耦合不充分；用量過多，對SOD活性中心與非活性中心氨基酸殘基均發(fā)生反應(yīng)，使SOD比活力下降。

2.2.4 丙酮添加量對修飾后SOD比活力的影響結(jié)果

圖4 丙酮添加量對SOD比活力的影響Fig.4 Effect of acetone dosage on SOD specific activity

由圖4可知，丙酮添加量為酶液體積的1.5倍時所沉淀的SOD修飾酶比活力最高，且和其他水平差異顯著。丙酮作為SOD的沉淀劑，體積分?jǐn)?shù)較小時，沉淀不完全，溶液中有游離SOD；體積分?jǐn)?shù)較大時，可將修飾液中其他雜蛋白充分沉淀，導(dǎo)致酶比活力下降。

2.3 正交試驗結(jié)果與分析

采用L9（34）試驗設(shè)計優(yōu)化修飾羊血SOD工藝條件，結(jié)果如表1所示。

表1 L9（34）正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 1 Design and results of L9((34) orthogonal array experimenttss

由表1極差值可知，影響月桂酸修飾SOD因素的主次順序為：A＞B＞C＞D。由K值可以確定月桂酸修飾SOD正交試驗的最優(yōu)組合是A3B2C2D2，即確定的最優(yōu)工藝參數(shù)為修飾溫度60 ℃、修飾時間30 min、月桂酰氯用量0.1 mL/10 mL酶液、丙酮添加量為酶液體積的1.5倍。

用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析，其結(jié)果如表2所示。因素A、B差異顯著P＜0.05，因素C、D不顯著，表明修飾溫度和修飾時間對本試驗的影響較大。

表2 正交試驗方差分析結(jié)果Table 2 Analysis of variance for the experimental results of orthogonal array design

2.4 驗證實驗結(jié)果

由于最優(yōu)組合在L9（34）正交試驗設(shè)計中未出現(xiàn)，需對正交試驗得到的最優(yōu)組合進(jìn)行驗證實驗。在修飾溫度60 ℃、修飾時間30 min、月桂酰氯添加量0.1 mL/10 mL酶液、丙酮添加量為酶液體積的1.5倍條件下修飾SOD，重復(fù)3次。測得SOD修飾酶平均比活力為3 398.3 U/mg，活力保留率為78.1%，比正交試驗中其它組合得到的酶比活力都高，可見其為正交試驗確定的最佳工藝參數(shù)。

2.5 修飾酶與天然酶的穩(wěn)定性比較

2.5.1 酶的溫度穩(wěn)定性

圖5 修飾酶和天然酶對不同溫度穩(wěn)定性的比較Fig.5 Stability of modified and natural SOD at different temperatures

由圖5可知，在55 ℃以下時，修飾酶和天然酶的相對酶活力大致相同，隨著溫度逐漸升高至95 ℃，天然酶的相對酶活力急劇下降，低至10%，而修飾酶的相對活力下降幅度較小，仍在原來酶活力48%以上。

2.5.2 酶的pH值穩(wěn)定性

圖6 修飾酶和天然酶對不同pH值穩(wěn)定性的比較Fig.6 Stability of modified and natural SOD at different pHs

由圖6可知，修飾酶及天然酶的最適pH值均為7.0，隨著pH值的升高或減小，兩種酶活力都有所下降，但在極端酸堿條件下，修飾酶相對酶活力高達(dá)67.1%，而天然酶相對酶活力僅為35.4%。

2.5.3 修飾酶和天然酶半衰期測定

經(jīng)計算在4 ℃保存條件下，天然酶半衰期為4 d，修飾酶半衰期為141.5 d，比天然酶提高了137.5 d。

與天然SOD酶學(xué)性質(zhì)相比較，由于在修飾SOD過程中，月桂酰氯耦合在了SOD的非活性基團(tuán)上，在酸堿強度較大、溫度較高條件下不易影響SOD酶活性中心，從而使修飾酶活性保持較好的穩(wěn)定性。

3 結(jié) 論

本實驗以新鮮羊血中提取的SOD原料，根據(jù)不同單因素條件試驗結(jié)果，對月桂酰氯修飾羊血SOD的主要影響因素進(jìn)行L9（34）正交試驗優(yōu)化，確定的最優(yōu)工藝參數(shù)為10 mL酶比活力為4 348.6 U/mg的SOD樣液、修飾溫度60 ℃、修飾時間30 min、月桂酰氯用量0.1 mL、丙酮添加量為酶液體積的1.5倍，在此條件下修飾SOD，所得SOD平均比活力為3 398.3 U/mg。

天然酶與修飾酶理化性質(zhì)測定結(jié)果表明：SOD經(jīng)月桂酸修飾后熱穩(wěn)定性、pH值耐受性、半衰期等均優(yōu)于天然酶。月桂酰氯酸修飾SOD擴(kuò)展了SOD的實用價值，有利于它在食品、日化及藥物等方面的實際應(yīng)用。

[1] BULLOCK J, CHOWDHURY S, SEYERDIA A, et al. Comparison of results of various methods used to determine the extent of modification of methoxy polyethylene glycol5000-modified bovine cupri-zinc superoxide dismutase[J]. Analytical Biochemistry, 2007, 254(2): 254-262.

[2] NAMIR I A, HADDAD Q. Purification of copper-zincsuperoxide dismutase from Semen Lethospermi (SL) by copper-chelate affinity chromatography[J]. China Journal Nature Medicine, 2004, 6(2): 379-384.

[3] 杜秀敏, 殷文璇, 張慧, 等. 超氧化物歧化酶(SOD)的研究進(jìn)展[J].中國生物工程雜志, 2003, 23(1): 48-50.

[4] 楊學(xué)山, 付文力, 孔志亮, 等. 銅鹽-熱變性法分離提取羊血超氧化物歧化酶工藝條件優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(20): 42-45.

[5] MATTIAS B, MAKA I, SAMAIL M, et al. Integrated operation of continuous chromatography and transformations for the generichigh yield production of fine chemicals[J]. Journal of Biotechnology, 2006, 25(8): 146-162.

[6] DANIEL A, RUTH E S. Modeling suberization with peroxidasecatalyzed polymerization of hydroxycinnamic acids: cross-coupling and dimerization reactions[J]. Photochemistry, 2006, 17(6): 743-753.

[7] LIN C, LEE T L, DUAN K, et al. Molecular cloning, characterization, and expression of a cDNA coding copper/zinc superoxide dismutase from black porgy[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008, 48(8): 4-7.

[8] 高巍, 孫慶林. 羊血銅鋅超氧化物歧化酶(Cu-ZnSOD)的分離純化[J]. 生物技術(shù), 2010, 20(1): 86-89.

[9] MAIRKOVSKY M, ZIV V, NEVO N. Cu/Zn superoxide dismutase plays important role in immune response[J]. The Journal of Immunology, 2003, 25(6): 2993-3001.

[10] 桂興芬, 楊萍, 鄒國林. 月桂酸修飾超氧化物歧化酶的制備及其穩(wěn)定性研究[J]. 武漢大學(xué)學(xué)報: 自然科學(xué)版, 2005, 44(4): 498-500.

[11] 齊敬總, 王鳳山, 張鴻偉, 等. 低分子肝素修飾超氧化物歧化酶及修飾酶的理化性質(zhì)研究[J]. 中國藥學(xué)雜志, 2006, 41(2): 150-153.

[12] 吳云, 袁勤生. 修飾超氧化物歧化酶的制備、性質(zhì)及代謝[J]. 華東化工學(xué)院學(xué)報, 1998, 14(6): 664-667.

[13] 劉小云, 葉松柏, 譚紫電. 超氧化物歧化酶的化學(xué)修飾[J]. 四川生理科學(xué)雜志, 2004, 16(1): 25-33.

[14] 鄒國林, 夏璐, 李鵬, 等. 有機(jī)溶劑可溶的超氧化物歧化酶制備及其性質(zhì)[J]. 生物化學(xué)與生物物理學(xué)報, 1996, 28(1): 83-85.

[15] 李東華, 王鴻, 孫漢棟, 等. 超氧化物歧化酶吸附分離-化學(xué)修飾的耦合過程[J]. 化工進(jìn)展, 2009, 28(1): 135-140.

[16] 周志剛. 超氧化物歧化酶的化學(xué)修飾進(jìn)展[J]. 安徽醫(yī)藥, 2010, 14(6): 623-626.

[17] 楊學(xué)山, 楊孝樸, 楊志杰, 等. 離子交換層析法純化羊血SOD及其穩(wěn)定性研究[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2010, 45(5): 157-160.

[18] 宋宏新. 現(xiàn)代生物化學(xué)實驗技術(shù)教程[M]. 西安: 陜西人民出版社, 2002: 157-162.

[19] 楊明琰, 張曉琦, 沈儉. 超氧化物歧化酶兩種鄰苯三酚自氧化測定活力方法的比較[J]. 微生物學(xué)雜志, 2006, 26(3): 40-42.

[20] 申煜, 魏建民, 常弘. 牛血Cu/Zn-SOD的熱穩(wěn)定性及動力學(xué)研究[J].動物學(xué)雜志, 2004, 39(5): 78-80.

Optimized Preparation and Enzymatic Characterization of Lauroyl Chloride Modified SOD from Sheep Blood

YANG Xue-shan, WANG Ben-qi, WANG Zheng-juan, YANG Zuo-qing, LI Yuan-ling, KANG Yan-liang
(College of Life Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

The process condition for modifying SOD from sheep blood by lauroyl chloride was explored. Four experimental parameters including reaction temperature, reaction time and the amounts of lauroyl chloride and acetone added to SOD solution were investigated by one-factor-at-a-time experiments and optimized by orthogonal array design. The highest enzyme activity was observed for SOD with a specific activity of 4 348.6 U/mg in a 10 mL aqueous solution when modified by reaction with 0.1 mL of lauroyl chloride and 15 mL of acetone for 30 minutes at 60 ℃. The modified SOD exhibited improved heat stability, pH tolerance and half-life compared to the intact one. Therefore, lauroyl chloride can be used to modify sheep blood SOD for better enzymatic performance.

sheep blood SOD; lauroyl chloride; modification; enzyme activity

TS251.9

A

1002-6630（2014）07-0128-04

10.7506/spkx1002-6630-201407026

2013-04-12

甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究與應(yīng)用開發(fā)項目（GNSW-2010-03）；甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生科研訓(xùn)練計劃重點項目（20120803）

楊學(xué)山（1977—），男，副教授，碩士，主要從事生物化學(xué)與生物制品開發(fā)研究。E-mail：yangxs@gsau.edu.cn