Spinigerin α抗菌肽中試化發酵條件的研究

陳曉平，房丹丹

（吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118）

Spinigerin α抗菌肽中試化發酵條件的研究

陳曉平，房丹丹

（吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118）

在已獲得Spinigerin α抗菌肽搖瓶發酵條件的基礎上，對其在50 L發酵罐中的初始甘油質量濃度、補料方式、甲醇與山梨 醇混合比例、誘導溫度、誘導pH值和誘導時間進行優化，并對誘導階段甲醇與山梨醇混合體積比、誘導溫度和誘導pH值進行正交試驗。結果表明：甘油初始質量濃度10 g/L、補料方式為變速補料、甲醇與山梨醇混合體積比1∶1、誘導時間96 h、誘導溫度24℃、誘導pH 5.0。在此最佳發酵條件下，50 L發酵罐的Spinigerin α抗菌肽產量較搖瓶條件提高20%。

spinigerin α抗菌肽；中試化；發酵條件

抗菌肽是由生物細胞特定基因編碼，經誘導產生的一類具有抗菌活性的小分子多肽，大小一般在2～7 kD左右，氨基酸組成小于100個，具有廣譜殺菌、強堿性、水溶性和熱穩定性好等特點[1]。目前抗菌肽的制備主要是通過提取法、化學合成法及基因工程法，然而根據其各種特點來說，基因工程表達是大量獲得抗菌肽的有效途徑。

S p i n i g e r i n抗菌肽是一種來源于白蟻（Pseudacanthotermes spiniger）的線性抗菌肽[1]，包括25個氨基酸。該抗菌肽中的一個含有18個氨基酸的α-螺旋結構（Lys4至Leu21）保留了抗菌活性，本研究室將其命名為Spinigerin α，并已成功構建成外分泌型重組表達載體pPICZaA-Spinigerin α，將其轉入GS115酵母菌體內獲得重組菌GS115-S α。經誘導表達，證實其上清液對大多革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌）以及部分革蘭氏陰性菌（大腸桿菌、志賀氏菌）具有明顯的抑菌活性。

由于抗菌肽具有廣泛的應用價值[2]，已受到國內外研究者的高度重視，而關于抗菌肽的研究也只局限于基因的克隆與表達，對于后期大批量生產還沒有相關報道。畢赤酵母（Pichia pastoris）是一種能高效表達外源蛋白的表達系統，具有遺傳穩定、表達水平高、蛋白可翻譯后加工、產物可分泌、可高密度發酵等許多優點[3-5]，且畢赤酵母不會因發酵產物的累積影響正常生長代謝，也易于從搖瓶培養擴大到大批量高密度發酵，因此具有用于高密度發酵的巨大潛力。

中試工藝是連接研發和生產的重要平臺，是科技成果向生產力轉化的重要環節[6]。本研究在前期實驗獲得搖瓶發酵最佳條件的基礎上，通過對Spinigerin α抗菌肽50 L發酵罐中試化發酵條件的研究[7-9]，旨在獲得Spinigerin α抗菌肽中試化最佳生產條件，為其工業化生產提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 菌株

重組Spinigerin α抗菌肽菌株由吉林農業大學食品生物化學實驗室提供；金黃色葡萄球菌 本實驗室保藏菌種。

1.2 試劑

氨芐青霉素（ampicillin，Amp） 鼎國生物技術發展中心；蛋白胨、酵母提取物、瓊脂 長春科隆公司；山梨醇、無氨基酵母氮源（yeast nitrogen base，YNB）培養基、Zeocin 美國Invitrogen公司；甘油、甲醇等其他試劑均為國產分析純試劑。

1.3 儀器與設備

－80℃超低溫冰箱 美國Thermo Forma公司；恒溫搖床 哈爾濱東明醫療器械廠；PYX-DHS恒溫培養箱上海躍華醫療器械廠；AUY220電子天平 日本島津制作所；T6紫外-可見光分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；SDJ-5L-50L/C 50 L發酵罐 上海聯環生物工程設備有限公司。

1.4 培養基

酵母蛋白胨葡萄糖培養基（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）：酵母提取物1 g/100 mL、蛋白胨2 g/100 mL、葡萄糖2 g/100 mL（固體培養基加入2 g/100 mL瓊脂）。

1/4基礎鹽培養基（basic salt medium，BSM）：85% H3PO46.67 mL/L、CaSO4·2H2O 0.23 g/L、K2SO44.55 g/L、MgSO4·7H2O 3.72 g/L、KOH 1.03 g/L、甘油10 g/L，121℃、30 min高壓滅菌。

甘油補料培養基：體積分數50%甘油、PTM1 4.35 mL/L。甲醇誘導培養基：體積分數50%甲醇、PTM1 12 mL/L。山梨醇補料培養基：體積分數5 0%山梨醇、PTM1 12 mL/L。

P T M 1微量元素：C u S O4·5 H2O 6.0 g/L、MgSO4·H2O 3.0 g/L、H3BO30.02 g/L、ZnCl220.0 g/L、生物素0.20 g/L、NaI 0.08 g/L、Na2MoO40.2 g/L、CoCl20.5 g/L、FeSO4·2H2O 65 g/L、H2SO45.0 mL/L，0.22 μm濾膜過濾除菌4℃備用。

1.5 方法

1.5.1 種子培養

一級種子培養：取－80℃凍存的菌種，劃YPD平板（每100 mL含100 μL Zeocin），28℃培養2 d直至長出單菌落，挑取單菌落至50 mL液體YPD培養基中，28℃、300 r/min振蕩培養18 h，得一級種子。

二級種子培養：將一級種子按體積分數10%接種量接種到含有2 L YPD培養基的5 L種子罐中，28℃、300 r/min振蕩培養24 h，得二級種子。

1.5.2 發酵罐培養

二級種子液培養至OD600nm在2～6時，按照8%接種量接種到含有20 L BSM培養基的50 L發酵罐中進行發酵，通入無菌空氣（15 L/min）調節溶氧20%以上，轉速650 r/min，誘導前溫度控制在28℃，通過補加25%氨水控制pH值為6.0；初始培養基中甘油耗盡時，溶氧會突然上升至80%左右，此時開始補加甘油進入細胞增殖階段；細胞增殖20 h后進入誘導階段，每12 h補加甲醇進行誘導，保持發酵液中甲醇終體積分數為1%左右；整個發酵持續120 h，發酵結束后4℃、12 000 r/min離心10 min收集上清液備用。

1.5.3 菌液濃度測定

發酵開始后每12 h取發酵液，測定OD600nm值，以相同體積的培養基做空白對照。

1.5.4 表達產物抑菌活性檢測

將處于對數生長期的金黃色葡萄球菌懸浮液100 ?L，均勻涂于LB固體培養基平板上，用滅菌打孔器（直徑3 mm）打孔，滴加50 ?L待測的發酵液上清，以同體積pPICZα A空載體轉化酵母表達蛋白為陰性對照，以50 ?L Amp（100 ?g/mL）為陽性對照。37℃培養過夜后測量抑菌直徑。

1.5.5 總蛋白質含量測定

用Bradford 蛋白定量試劑盒分別測定發酵罐上清液中的總蛋白質含量、搖瓶條件表達上清液總蛋白質含量、pPICZα A空載體轉化酵母表達上清液總蛋白質含量。

1.5.6 發酵條件優化的單因素試驗

1.5.6.1 初始發酵培養基中甘油質量濃度

將BSM基礎鹽培養基中的初始甘油質量濃度分別設為5、10、20、35、55 g/L，其他條件按照1.5.2節，培養20 h測定菌體濃度，重復7次取平均值。

1.5.6.2 甘油補料方式

分批補料發酵培養開始后，溶氧突然上升說明初始發酵培養基中甘油耗盡，一次加入終質量濃度為40 g/L甘油培養4 h和變速補加甘油培養4 h，第1小時補加5 g/L、第2小時增加到10 g/L、第3小時繼續補加10 g/L、第4小時減少到8 g/L，其他條件按照1.5.2節，補加結束后取發酵液測菌體濃度，重復7次取平均值。

1.5.6.3 甲醇補料方式

甘油補料結束后，饑餓0.5 h，進入甲醇誘導階段，分別以下列3種方式添加甲醇進行誘導。方法1：每12 h補加一次甲醇使其終體積分數為1.0%；方法2：先補加發酵液總體積0.5%的甲醇，當該體積分數甲醇消耗完后開始每小時補加6 g/L甲醇，20 h后將補加量提高到20 g/L，并維持至發酵結束；方法3：誘導初期開始每小時添加6 g/L甲醇，20 h后將補加量提高到20 g/L，并維持至發酵結束。通過調節轉速和通氣量使溶氧量在20%以上，保證發酵結束后誘導所用甲醇體積分數相同，其他條件按照1.5.2節，收集上清液做抑菌實驗，重復7次取平均值。

1.5.6.4 甲醇與山梨醇混合體積比

誘導階段采用混合碳源進行誘導表達，甲醇與山梨醇體積比分別設為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，進行誘導表達，其他條件按照1.5.2節，發酵結束后收集上清液做抑菌實驗，重復7次取平均值。

1.5.6.5 誘導時間

誘導過程中，分別在24、48、72、96、120 h收集上清做抑菌實驗，重復7次取平均值。

1.5.6.6 誘導溫度

甘油補料結束后，饑餓0.5 h，進入甲醇誘導階段之前，將溫度分別設定為22、24、26、28、30 ℃，然后進行甲醇誘導表達，其他條件按照1.5.2節，發酵結束后收集上清液做抑菌實驗，重復7次取平均值。

1.5.6.7 誘導pH值

甘油補料結束后，饑餓0.5 h，進入甲醇誘導階段之前，將pH值分別設定為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，然后進行甲醇誘導表達，其他條件按照1.5.2節，發酵結束后收集上清液做抑菌實驗，重復7次取平均值。

1.5.7 正交試驗篩選最佳發酵條件

將單因素優化的甲醇與山梨醇混合體積比例、誘導溫度、誘導pH值進行三因素三水平正交試驗，以期獲得最佳誘導條件組合。

2 結果與分析

2.1 最佳發酵條件的單因素試驗

2.1.1 初始發酵培養基中甘油質量濃度對發酵初期菌體密度的影響

圖1 初始發酵培養基中甘油質量濃度對發酵初期菌體密度的影響Fig.1 Effect of initial glycerol concentration in the fermentation medium on cell density

初始發酵培養基中甘油濃度對發酵初期菌體密度影響如圖1所示。初始培養基中甘油質量濃度10 g/L時，甘油會很快耗盡，補料時間提前，對補料前的生長階段非常有利。所以如果能夠在后期甘油補料過程中控制適當的甘油質量濃度，可使培養基中的菌體一直保持較好的狀態，從而有效地縮短發酵時間，提高菌體密度。

2.1.2 不同甘油補料方式對發酵初期菌體密度的影響

圖2 不同甘油補料方式對發酵初期菌體密度影響Fig.2 Effect of glycerol-feeding methods on cell density

不同甘油補料方式對發酵初期菌體密度的影響如圖2所示。一次性補加甘油時菌體密度增長不如變速式補加甘油增長的快，原因可能是瞬間甘油過量改變了培養基中各組分的比例，使酵母生長環境改變較大，對菌體生長產生一定限制。而變速式補加甘油使發酵液中甘油質量濃度一直維持在菌體最適生長濃度從而有利于菌體快速增長，在對數期達到較高的菌體密度，為后期誘導產生更多的目的產物提供基礎。

2.1.3 甲醇補料方式對發酵后期產物的影響

圖3 甲醇補料方式對發酵后期產物影響Fig.3 Effect of methanol-feeding methods on the antibacterial activity of fermentation end-products

甲醇補料方式對發酵后期產物影響結果如圖3所示。方法2抗菌肽的表達量最高，甲醇是在畢赤酵母產抗菌肽的過程中既是碳源又是誘導物，甲醇的體積分數及其補加方式對抗菌肽的表達影響很大，甲醇體積分數過高會對細胞產生毒害作用，而甲醇體積分數過低則不能有效誘導醇氧化酶啟動子AOX的轉錄。而方法2使甲醇一直維持在誘導最適濃度，這樣對對外源蛋白高效表達非常有利。所以甲醇最終補加方式選擇方法2。

2.1.4 甲醇與山梨醇混合比例對發酵后期產物的影響

甲醇與山梨醇混合比例對發酵后期產物影響研究結果如圖4所示。甲醇與山梨醇混合體積比為1∶1時，抑菌效果要高于其他混合比例，因此確定最佳甲醇與山梨醇混合體積比為1∶1。

圖4 甲醇與山梨醇混合體積比對發酵后期產物影響Fig.4 Effect of methanol/sorbitol ratio on the antibacterial activity of fermentation end-products

2.1.5 誘導時間對發酵后期產物影響

圖5 誘導時間對發酵后期產物影響Fig.5 Effect of induction duration on the antibacterial activity of fermentation end-products

誘導時間對發酵后期產物影響研究結果如圖5所示。誘導96 h抗菌肽表達量最高，之后隨誘導時間的增長抗菌肽表達量有所下降，可能是由于代謝產物積累，導致抗菌肽降解所致。因此確定抗菌肽的最佳誘導時間為96 h。

2.1.6 誘導溫度對發酵后期產物影響

圖6 誘導溫度對發酵后期產物影響Fig.6 Effect of induction temperature on the antibacterial activity of fermentation end-products

誘導溫度對發酵后期產物影響研究結果如圖6所示。誘導階段的溫度過高會使菌體過早衰老，發酵周期縮短，降低蛋白表達量和活性，28 ℃比30 ℃抗菌肽的表達量高，因此確定最佳誘導溫度為28 ℃。

2.1.7 誘導pH值對發酵后期產物影響

誘導pH值對發酵后期產物影響研究結果如圖7所示。pH值對菌體生長和誘導表達都會產生影響，尤其是誘導時的pH值，不僅會影響蛋白表達量和活性，而且會通過影響蛋白酶活性，來改變蛋白的降解程度，選擇誘導pH值為5.5，此時抗菌肽表達量最高。

圖7 誘導pH值對發酵后期產物影響Fig.7 Effect of induction pH on the antibacterial activity of fermentation end-products

2.2 最佳發酵條件的正交試驗正交試驗優化方案及結果如表1所示。從極差R可以看出，3個因素的影響大小依次為：A＞C＞B，最優組合為：A1B3C3，即甲醇與山梨醇體積比為1∶1、誘導pH 5.0、誘導溫度24 ℃，此條件下誘導產生的抗菌肽表達量最高。

表1 抗菌肽中試化發酵條件正交試驗（L9（33）設計方案及結果Table 1 Orthogonal array design L9 (33) and resullttss

2.3 表達產物抑菌活性

圖8 Spinigerin 對金黃色葡萄球菌的抑制作用Fig.8 Inhibitory effect of Spinigerin α on Staphylococcus aureus

發酵罐表達上清液與搖瓶發酵表達上清液對金黃色葡萄球菌抑菌作用結果如圖8所示。畢赤酵母可以從搖瓶水平擴大到發酵罐培養，且通過本實驗對發酵罐中幾個影響發酵的因素進行優化使其產量較搖瓶水平有所提高，陽性對照顯示Spinigerin α抗菌肽抑菌活性較同體積Amp強，陰性對照無抑菌活性，因此排除了除Spinigerin α抗菌肽其他成分的抑菌作用，說明后期應用畢赤酵母表達抗菌肽只要將影響發酵條件的因素全部找到并且進行優化，相信畢赤酵母表達抗菌肽可以實現工業化生產。

2.4 蛋白質含量測定結果

通過發酵罐最終獲得Spinigerin α抗菌肽19.2 mg/L，搖瓶條件下Spinigerin α抗菌肽為16 mg/L，發酵罐比搖瓶條件下表達量提高了20%，抑菌活性也明顯提高。

3 討 論

溶氧是酵母生長過程中最重要的營養成分之一，可直接影響酵母的生長和代謝[10-13]，同時溶氧在一定程度上也反映了培養基中碳源的消耗情況，為及時補加碳源提供依據，溶氧逐漸下降說明菌體生長消耗了氧氣，溶氧突然上升表明菌體營養缺乏，需要補加營養物質，但溶氧過低過高都不適合酵母生長。本實驗根據文獻選擇了溶氧控制在20%的培養條件，酵母生長正常。

Spinigerin α抗菌肽發酵過程概括起來包括兩大部分，一是菌體的增殖階段，二是誘導表達階段，而后者直接影響了目的產物的產量，周祥山[14]、Chauhan[15]、Zhu Taicheng[16]等采用在低溫條件下，山梨醇與甲醇混合誘導，實現了β-甘露聚糖酶迄今為止最高產量6 336 U/mL。汪志浩[17]、Soyaslan[18]等通過優化pH值證明，在pH值大于5.0時山梨醇消耗速率下降，而當pH值為4.5時紅細胞生成素最高產量為0.16 g/L。因此本實驗在前期實驗基礎上，對誘導階段甲醇與山梨醇混合體積比、誘導溫度和誘導pH值三者的綜合影響進行正交優化試驗研究。結合菌體增殖階段優化得到的最優條件，實現了Spinigerin α抗菌肽50 L規模化生產。一般而言，提高發酵規模，發酵能力會有所下降，而本實驗卻有所提高，考慮可能與發酵罐中可以準確的控制溶氧﹑控制細胞增殖與誘導階段補料量和整個發酵過程中采用變溫與變pH值發酵有關。

近幾年研究發現在畢赤酵母表達體系中，山梨醇和甲醇的混合補料不但可以增加細胞密度縮短誘導時間，最重要的是可以提高外源蛋白的表達量。由于甘油混合誘導會抑制啟動子AOX1的活性，不利外源蛋白的表達，而山梨醇則不會因為其積累而抑制AOX1的活力[19-20]，因此本實驗直接選用山梨醇與甲醇混合補料進行研究。

Spinigerin α抗菌肽中試化生產的最佳發酵條件為：8%接種量接入裝有20 L BSM基礎鹽培養基的50 L發酵罐中，溶氧20%，轉速650 r/min，誘導前溫度為28 ℃、pH值為6.0進行發酵培養；初始培養基中甘油耗盡后，溶氧急劇上升至80%左右，開始補加甘油，第1小時補加5 g/L，第2小時增加到10 g/L，第3小時繼續補加10 g/L，第4小時減少到8 g/L；待甘油耗盡溶氧再次上升至80%左右，此時饑餓0.5 h以將發酵液中殘存的阻遏性碳源物質（甘油和乙醇）消耗盡，進入甲醇與山梨醇混合誘導階段；控制誘導溫度為24 ℃，pH值為5.0，先向培養基中加入終體積分數為0.5%的甲醇，待初始甲醇耗盡，開始每小時補加甲醇與山梨醇（體積比1∶1）6 g/L維持此速度誘導4 h，使菌體適應甲醇誘導，之后速度增加到20 g/L，整個發酵過程持續96 h。在此最佳發酵條件下，Spinigerin α抗菌肽的50 L發酵罐產量較搖瓶條件下提高20%。

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Optimization of Pilot-Scale Fermentation Conditions for the Production of Spinigerin α as an Antibacterial Peptide

CHEN Xiao-ping, FANG Dan-dan
(College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

In this study, various fermentation conditions for the production of the antibacterial peptide Spinigerin α in a 50-L fermentor, including initial glycerol concentration, feeding methods, methanol/sorbitol ratio, induction temperature, pH and time were optimized based on the previously established shake flask fermentation conditions. An orthogonal array design involving methanol/sorbitol ratio (V/V), induction temperature and pH was used. Results showed that the optimal pilot-scale fermentation conditions were 10 g/L initial glycerol concentration, feeding at variable speeds, 1:1 methanol/sorbitol ratio (V/V) and induction at 24 ℃ and pH 5.0 for 96 h. The yield of Spinigerin α in a 50 L fermentor under the optimized conditions was increased by 20% than under shake flask fermentation conditions.

the antibacterial peptide Spinigerin α; pilot scale; fermentation conditions

TQ92

A

1002-6630（2014）07-0138-05

10.7506/spkx1002-6630-201407028

2013-03-31

吉林省科技廳科技發展計劃項目（20060208）

陳曉平（1963—），男，教授，博士，研究方向為食品生物技術與功能食品。E-mail：837340652@qq.com