蛋清肽的制備及其對保加利亞乳桿菌促生長的作用

任 靜，孫 波*，趙 曉，孫欣瑤，齊 玉，李海鑫，樊 慶，孫 盛

（東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

蛋清肽的制備及其對保加利亞乳桿菌促生長的作用

任 靜，孫 波*，趙 曉，孫欣瑤，齊 玉，李海鑫，樊 慶，孫 盛

（東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

研究Alcalase堿性蛋白酶酶解蛋清制備蛋清肽和蛋清肽對保加利亞乳桿菌生長的影響。結果表明：通過Box-Behnken設計確定酶解的最佳工藝為：底物質量濃度4.5 g/100 mL、酶解pH 9.0、酶解溫度64℃、加酶量（[E]/[S]）5.0%，此條件下，酶解3 h后水解度達21.89%。蛋清肽可顯著促進保加利亞乳桿菌生長，當添加體積分數3.0%、酶解3 h的蛋清肽（分子質量主要集中在1 513 u）時，其促生長效果最好，此時，與未添加蛋清肽組相比，活菌數提高了1（lg（CFU/mL））。

蛋清肽；保加利亞乳桿菌；促生長

保加利亞乳桿菌作為我國衛生部列出的9類益生菌之一，其在食品、醫療保健等領域的應用越來越廣[1-3]。然而，國際和國內規定中聲明，益生菌活菌數不得少于106CFU/mL或106CFU/g，否則不能產生渴望的健康訴求[4]，因此，如何促進保加利亞乳桿菌快速生長、提高保加利亞乳桿 菌的活菌數量則成為大規模酶制劑生產中的一項重要任務。

蛋清肽是蛋清經蛋白酶適度水解生成的多肽混合物，蛋清中含有豐富的蛋白質和人體必需的多種氨基酸，且氨基酸組成配比均衡性好，是營養學界公認的機體利用率最高、最優質的蛋白質[5-6]。水解后的蛋清肽不僅分子質量小，利于吸收，且許多具有獨特序列的肽還具有特殊的生理功效[7-11]。近年來，國內外已有相關研究報道乳蛋白、綠豆蛋白、大豆蛋白、酪蛋白、魚蛋白來源的肽具有不同程度促進乳酸菌生長的影響[12-18]，然而，有關蛋清肽對乳酸菌生長的影響鮮見報道。

本實驗以雞蛋蛋清為原料，采用Alcalase堿性蛋白酶酶解制備蛋清肽，利用Box-Behnken響應面分析法優化蛋清肽制備工藝，并進一步探討蛋清肽對保加利亞乳桿菌生長的影響，旨在為提高保加利亞乳桿菌的活菌數量、促進蛋清肽在乳制品生產中的應用提供一定的理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋 市售。

Alcalase堿性蛋白酶（24萬U/mL） 諾維信生物制品有限公司；Sephadex G-25 美國Pharmacia公司。

1.2 菌種與培養基

保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus） 東北農業大學食品學院保藏。

MRS培養基（g/L）：蛋白胨10.0、葡萄糖20.0、牛肉膏10.0、酵母膏5.0、無水乙酸鈉5.0、檸檬酸二銨2.0、硫酸鎂0.58、硫酸錳0.28、瓊脂15.0、吐溫-80 1.0 mL/L，pH 6.2～6.4，121 ℃滅菌15 min。

1.3 儀器與設備

HYP-Ⅱ型消化爐 上海纖檢儀器有限公司；JJ-1型電動攪拌器 常州國華電器有限公司；HD-1型核酸蛋白檢測儀 金壇市盛藍儀器制造有限公司；PHS-3C型精密pH計 上海精密科學儀器有限公司；CJ-2D型超凈工作臺 天津泰斯特儀器有限公司；TDZ4低速離心機上海平凡儀器儀表有限公司；DHP-9162恒溫培養箱、HWS-24電熱恒溫水浴鍋 上海齊欣科學儀器有限公司；722可見分光光度計 天津市普瑞斯儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 蛋清肽的制備

稱取一定量攪打后的雞蛋蛋清，加水稀釋至一定蛋白質質量濃度后，沸水浴加熱處理15 min，加入Alcalase堿性蛋白酶酶解，酶解后95 ℃保溫10 min滅酶，冷卻，4 000 r/min離心30 min，上清液即為蛋清肽。

1.4.2 水解度的測定

采用茚三酮比色法[19]測定。

1.4.3 蛋清肽分子質量測定

采用凝膠柱層析法測定蛋清肽的分子質量分布。層析條件為：Sephadex G-25柱（2.6 cm×50 cm），流速1.0 mL/min，0.1 mol/L pH 7.0磷酸緩沖液洗脫；溫度23 ℃；檢測波長280 nm。

取苯丙氨酸（Mw=168 u）、還原型谷胱甘肽（Mw=307 u）、氧化型谷胱甘肽（Mw=612 u）、桿菌肽（Mw=1 422 u）、溶菌酶（Mw=14 000 u）各10 mg，分別溶于1 mL洗脫液中，制成標準溶液。將處理好的交聯葡聚糖凝膠（Sephadex G-25）裝柱，按照上述條件操作，用記錄儀記錄流出液吸收情況。洗脫液洗脫至基線平穩，加入標準溶液或樣品0.2 mL，用量筒記錄最大吸收峰出現時洗脫液流出體積。

1.4.4 保加利亞乳桿菌活菌數測定

參照GB/T 4789.35—2010《食品微生物檢驗 食品中乳酸菌檢驗》方法測定。

1.4.5 滴定酸度測定

參照GB 5413.34—2010《乳和乳制品酸度的測定》方法測定。

2 結果與分析

2.1 蛋清肽酶解工藝條件的優化

2.1.1 酶解pH值對水解度的影響

pH值是酶促反應的重要參數，其過高或過低均會抑制酶的活性，進而降低反應速率。底物質 量濃度4.0 g/100 mL、酶解溫度60 ℃、加酶量（[E]/[S]）4.0%、酶解3 h，研究pH值對蛋清肽水解度的影響，結果如圖1所示，pH值以9.0為宜。

圖1 酶解pH值對蛋清肽水解度的影響Fig.1 Effect of pH on the degree of hydrolysis

2.1.2 酶解溫度對水解度的影響

底物質量濃度4.0 g/100 mL、加酶量4.0%、酶解pH 9.0、酶解3 h，研究酶解溫度對蛋清肽水解度的影響，結果如圖2所示，當溫度低于65 ℃時，隨著酶解溫度的升高，水解度也隨之增加，但當酶解溫度大于65 ℃時，隨著酶解溫度的升高，水解度顯著下降，可見，過高的溫度破壞了酶的活性中心，改變了酶的構象，進而導致酶切作用迅速降低，因此，本實驗中，溫度以65 ℃為宜。

圖2 酶解溫度對蛋清肽水解度的影響Fig.2 Effect of hydrolysis temperature on the degree of hydrolysis

2.1.3 底物質量濃度對水解度的影響

圖3 底物質量濃度對蛋清肽水解度的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on the degree of hydrolysis

底物質量濃度過高，加熱變性后蛋白凝固而形成凝膠狀，不利于酶的作用；底物質量濃度過低，又會降低生產效率。加酶量4.0%、酶解pH 9.0、酶解溫度65 ℃、酶解3 h，研究底物質量濃度對蛋清肽水解度的影響，結果如圖3所示，底物質量濃度以4.5 g/100 mL為宜。

2.1.4 加酶量對水解度的影響

加酶量越大，其與底物蛋白接觸的幾率越大，水解度也會隨之增加，但加酶量過大則會造成資源浪費，成本增加。底物質量濃度4.5 g/100 mL、酶解pH 9.0、酶解溫度65 ℃、酶解3 h，研究加酶量對蛋清肽水解度的影響，結果如圖4所示，加酶量以6.0%為宜。

圖4 加酶量對蛋清肽水解度的影響Fig.4 Effect of enzyme concentration on the degree of hydrolysis

2.1.5 響應面法優化蛋清肽酶解工藝

表1 響應面分析試驗設計及結果Table 1 Experiment design and results for response surface analysis

在單因素試驗基礎上，選取蛋清肽酶解工藝中的4個因素，即酶解pH值、酶解溫度、底物質量濃度、加酶量為自變量，分別用x1、x2、x3、x4表示，以水解度Y為響應值，采用Design-Expert 7.0軟件中的Box-Behnken響應面設計原理設計響應面分析試驗，其結果見表1。

通過統計分析軟件Design-Expert 7.0對表1中試驗數據進行二次多項式回歸擬合，得二元回歸方程為：

Y=21.06－0.037x1－0.42x2－0.23x3－2.10x4－0.71x1x2＋0.12x1x3＋0.25x1x4－0.50x2x3＋0.19x2x4－0.035 x3x4－2.23x12－1.20x22－1.59x32－1.38x42

表2 模型方差分析Table 2 Analysis of variance for the response surface regression model

對模型進行方差分析，結果見表2，方程因變量與自變量之間的線性關系明顯，該模型顯著（P＜0.01），失擬項不顯著，且該模型相關系數R2=99.81%，校正決定系數表明該模型與實驗擬合良好，自變量與響應值之間線性關系顯著，可用于該反應的理論推測。由F檢驗得各因子的貢獻率依次為：x4＞x2＞x3＞x1，即加酶量＞酶解溫度＞底物質量濃度＞酶解pH值。由顯著性分析可知，x2、x3、x4、x1x2、x1x4、x2x3、x2x4、x12、x22、項達到了極顯著的水平。

圖5 各因素兩兩相互作用對蛋清肽水解度影響的響應面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots for the pairwise effects of four process conditions on the degree of hydrolysis of egg white

由圖5各因素對蛋清肽水解度影響的響應面和等高線圖可知，酶解pH值和酶解溫度、酶解pH值和加酶量、酶解溫度和底物質量濃度、酶解溫度和加酶量之間交互作用顯著。

2.1.6 驗證實驗

應用響應面法對回歸模型進行分析，確定蛋清肽酶解的最佳工藝條件為：酶解pH 8.99、酶解溫度63.87 ℃、底物質量濃度4.49 g/100 mL、加酶量5.22%；綜合考慮實際可操作性，將蛋清肽酶解的最佳工藝條件修整為：酶解pH 9.0、酶解溫度64 ℃、底物質量濃度4.5 g/100 mL、加酶量5.0%。在最優條件下對響應面法優化的結果進行驗證，3次平行實驗水解度的平均值為21.89%，接近Design Expert 7.0軟件得到的預測值21.93%，由此證明此響應面試驗參數準確，實驗模式合理。

2.1.7 蛋清肽分子質量的測定結果

一定分子質量的物質通過葡聚糖凝膠柱的時間或洗脫體積與分子質量的對數呈線性關系，分子質量越大，其通過凝膠柱的時間越短，洗脫體積越小[20]。按照1.4.3節所述的方法進行實驗，以各標準品分子質量對數為橫坐標（x），洗脫體積為縱坐標（y）繪制分子質量標準曲線，其回歸方程為y=－34.01x＋185.6（R2= 0.998 7），表明二者線性關系良好，可以用于分子質量的測定。

表3 不同酶解時間下蛋清肽的出峰體積及分子質量Table 3 Elution volumes and molecular weights of egg white peptides at different time points of hydrolysis

如表3和圖6所示，未水解的蛋清肽的出峰體積較小，為44 mL，其分子質量較大，為14 454 u；隨著酶解時間的延長，洗脫體積在44 mL處峰高越來越小，且最高峰逐漸后移，表明高分子質量蛋白逐漸被水解，分子質量逐漸變小；當酶解時間大于3 h時，隨著酶解時間的延長，其最高峰處的洗脫體積變化不大，最高峰的洗脫體積在77～78 mL之間，分子質量在1 513～1 445 u。

2.2 蛋清肽對保加利亞乳桿菌生長的影響

2.2.1 蛋清肽分子質量對保加利亞乳桿菌生長的影響

圖7 酶解時間對保加利亞乳桿菌生長的影響Fig.7 Effect of egg white peptides at different time points of hydrolysis on the growth of Lactobacillus bulgaricus

肽功能性與分子質量密切相關[21]。本實驗將已活化的保加利亞乳桿菌按體積分數3%接種量接種于MRS液體培養基中，并分別加入1%最佳酶解工藝條件下不同酶解時間（0、1、2、3、4 h）的蛋清肽，同時以乙酸銨（無機氮源）作為對照組，使各組培養基的含氮量相同，37 ℃培養24 h后測定各組發酵液的活菌數及滴定酸度，以此來初步研究蛋清肽分子質量對保加利亞乳桿菌生長的影響。由圖6、7可知，蛋清肽可顯著促進保加利亞乳桿菌的生長，且隨著酶解時間的延長，小分子質量肽段逐漸增多，其對保加利亞乳桿菌的促生長作用逐漸增強，但當酶解時間大于3 h時，小分子質量肽段含量幾乎不變，其促生長作用也增加緩慢，可見，肽分子質量越小，其促生長作用越強，這與Lucas等[13]的研究結果一致。針對本實驗蛋清肽促生長作用而言，蛋清肽的酶解時間以3 h為宜，此條件下制得的蛋清肽主要為分子質量集中于1 513 u的肽段（表3）。

2.2.2 蛋清肽添加量對保加利亞乳桿菌生長的影響

圖8 蛋清肽添加量對保加利亞乳桿菌生長的影響Fig.8 Effect of egg white peptide concentration on the growth of Lactobacillus bulgaricus

本實驗在保加利亞乳桿菌接種量為3%的MRS液體培養基中，分別加入1%、2%、3%、4%、5%最佳酶解工藝條件下酶解3 h的蛋清肽，以未添加蛋清肽作為對照，37 ℃培養24 h后，分別測定各組發酵液中的活菌數及滴定酸度，結果如圖8所示，蛋清肽的添加量顯著影響保加利亞乳桿菌的生長。當蛋清肽添加量為1.0%～3.0%時，隨著添加量的增加，保加利亞乳桿菌的活菌數及滴定酸度增加；當蛋清肽添加量為3.0%時，保加利亞乳桿菌的活菌數最多，為5.0×108CFU/mL，與對照組（2.8×107CFU/mL）相比，增加了一個數量級，這可能與添加蛋清肽增加了發酵液中肽和氨基酸的含量，提高乳酸菌生長所需的較理想的氮源密切相關；當蛋清肽添加量大于3.0%時，隨著添加量增加，保加利亞乳桿菌活菌數及滴定酸度逐漸降低，促生長作用逐漸減小；但當添加量為5.0%時，其對保加利亞乳桿菌生長具有抑制作用，這與胡志和等[16]的研究趨勢相同。可見，蛋清肽對保加利亞乳桿菌的促生長作用存在最適濃度范圍，并非添加量越大越好。

3 結 論

本實驗以雞蛋蛋清為原料，采用Alacase堿性蛋白酶酶解制備蛋清肽，確定其最佳制備工藝為：酶解pH 9.0、酶解溫度64 ℃、底物質量濃度4.5 g/100 mL、加酶量5.0%。此條件下，酶解3 h后其水解度達21.89%。

研究了蛋清肽對保加利亞乳桿菌生長的影響，結果表明，蛋清肽可顯著促進保加利亞乳桿菌生長，且隨著肽分子質量的減小，其促生長作用越強；此外，實驗中發現，蛋清肽對保加利亞乳桿菌的促生長作用存在最適濃度范圍，當添加3.0%、酶解3 h的蛋清肽時（分子質量主要集中在1 513 u），其對保加利亞乳桿菌的促生長作用最強，與未添加相比，可使活菌數提高一個數量級。

蛋清肽制備工藝簡單、操作方便，且廉價的蛋清肽可顯著促進保加利亞乳桿菌生長，降低生產成本，提高經濟效益，這不僅為保加利亞乳桿菌菌劑的大規模生產提供了一個新的途徑，同時也拓寬了蛋清肽的應用領域，提高了雞蛋的附加值，其應用前景廣闊。

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Preparation of Egg White Peptide and Its Growth-Promoting Activity for Lactobacillus bulgaricus

REN Jing, SUN Bo*, ZHAO Xiao, SUN Xin-yao, QI Yu, LI Hai-xin, FAN Qing, SUN Sheng
(College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Egg white was hydrolyzed by Alcalase to prepare egg white peptide in this study. The optimal hydrolysis parameters were determined by Box-Behnken experimental design as 4.5 g/100 mL substrate concentration, pH 9.0, 64 ℃ and 5.0% [E]/[S] ratio, yielding a degree of hydrolysis as high as 21.89% in 3 h of hydrolysis. Egg white peptide could obviously promote the growth of Lactobacillus bulgaricus. The best growth-promoting effect was achieved by addition of 3.0% by volume of egg white hydrolyzed for 3 h (mostly peptides with a molecular weight of 1 513 u), increasing the number of viable cells by 1 (lg(CFU/mL)) when compared with the blank control.

egg white peptide; Lactobacillus bulgaricus; growth-promoting

TS201.3

A

1002-6630（2014）07-0170-06

10.7506/spkx1002-6630-201407034

2013-03-04

任靜（1989—），女，碩士研究生，研究方向為食品微生物與發酵工程。E-mail：renjing114@163.com

*通信作者：孫波（1962—），男，副教授，碩士，研究方向為食品微生物與發酵工程。E-mail：bosun114@163.com