解淀粉芽孢桿菌產纖溶酶的19 L發酵罐實驗及其酶學性質

劉 林，謝 和*

（貴州大學生命科學學院，貴州 貴陽 550025）

解淀粉芽孢桿菌產纖溶酶的19 L發酵罐實驗及其酶學性質

劉 林，謝 和*

（貴州大學生命科學學院，貴州 貴陽 550025）

在搖瓶實驗的基礎上，對解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）GZJSI-12-7產纖溶酶最佳條件進行19 L發酵罐實驗，結果表明：GZJSI-12-7在發酵罐中培養6 h時開始產纖溶酶，78 h后纖溶酶產量基本穩定，達到4 178.39 IU/mL，產酶高峰比搖瓶發酵提前12 h左右。將發酵液經離心除菌、硫酸銨分級鹽析、透析除鹽、Sephadex G-75凝膠過濾，得到纖溶酶的純化倍數為9.84倍，酶活力回收率為42.52%，比活力為48 073.193 IU/mg。對纖溶酶的酶學性質研究表明，該酶的分子質量約為30.2 kD，最適溫度和pH值分別為40 ℃、7.5；在40 ℃以下酶的穩定性良好，超過50 ℃后酶活力迅速降低，耐熱性較差；金屬離子Mg2+、Ca2+、Mn2+對纖溶酶活性均有較強的激活作用，而Cu2+和Fe3+對酶活性具有明顯的抑制作用。

解淀粉芽孢桿菌；纖溶酶；發酵；分離純化；酶學性質

近年來，隨著人口老齡化趨勢的加劇和生活水平的逐步提高，我國心腦血管栓塞性疾病的發病率不斷上升，給人們的健康造成了嚴重的威脅[1-2]。溶栓療法是治療血栓類疾病最有效的手段之一，作為溶栓藥物的重要來源，微生物由于具有種類多、繁殖快并能產生大量胞外蛋白酶的優點，引起了人們的廣泛關注[3-4]。然而，目前國內微生物源纖溶酶的研究尚處于實驗室階段，幾乎還沒有微生物纖溶酶產品上市，主要是由于纖溶酶發酵產量較低的緣故，用野生型微生物進行液體發酵時的纖溶酶活力一般可達200～1 500 U/mL，誘變優化后可達600～3 000 U/mL，最高可達18 228 U/mL[5]。

本實驗室前期對分離自醬香型白酒酒曲中的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）GZJSI-12通過紫外線和亞硝基胍的復合處理，獲得了1株高產纖溶酶的突變株GZJSI-12-7，搖瓶優化后產酶活力高達4 789.08 IU/mL[6]。進一步對解淀粉芽孢桿菌GZJSI-12-7的搖瓶最佳發酵條件進行19 L發酵罐實驗，并對發酵液中的纖溶酶進行分離純化和酶學性質初步研究，為溶栓藥物的研究開發和纖溶酶的工業化生產提供理論依據和技術參數。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）GZJSI-12-7由分離自醬香型白酒酒曲中的GZJSI-12誘變所得[6]，仍具有較好的產醬香能力，保存于貴州大學生命科學學院微生物學實驗室。

1.1.2 培養基

固體斜面培養基：牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L，瓊脂20 g/L、pH 7.2～7.4，121 ℃滅菌30 min。

種子培養基：葡萄糖10 g/L、蛋白胨10 g/L、Na2HPO42 g/L、NaH2PO41 g/L、CaCl20.2 g/L、MgSO40.5 g/L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

發酵培養基[6]：葡萄糖30 g/L、蛋白胨10 g/L、吐溫-80 5 g/L、CaCl20.4 g/L、MgSO40.847 g/L、Na2HPO42 g/L、NaH2PO46.988 g/L，pH 9.0，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑

纖維蛋白原、凝血酶 美國Sigma公司；葡聚糖凝膠G-75 北京博奧拓達科技有限公司；即用型蛋白質分子質量標準（低） 日本TaKaRa公司；其他試劑均為國產分析純或進口分裝。

1.1.4 儀器與設備

L1523小型發酵罐（19 L） 瑞士比歐生物工程公司；2-16K高速冷凍離心機 美國Sigma公司；DYY-4C穩流穩壓定時電泳儀 北京市六一儀器廠；Gel Doc XR＋凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；THZ-160D氣浴恒溫振蕩器 上海博迅實業有限公司；SW-CJ-1FD標準型凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 纖溶酶酶活力測定

采用瓊脂糖-纖維蛋白平板法[7]測定纖溶酶酶活力，并以尿激酶（標準品）作纖溶酶酶活力標準曲線。

1.2.2 蛋白質標準曲線制作

以考馬斯亮藍G-250法測定發酵液的蛋白質含量，蛋白質標準曲線的制作參照文獻[8]。

1.2.3 19 L發酵罐實驗

對搖瓶優化出的最佳培養基成分和發酵條件[6]（裝液量和搖床轉速除外）進行19 L發酵罐實驗。發酵罐參數為：裝液量13 L，轉速設定為350 r/min、通氣量6 L/min、發酵96 h，每隔6 h取樣測纖溶酶活性。

1.2.4 纖溶酶的分離純化

1.2.4.1 分段鹽析提取纖溶酶

將GZJSI-12-7發酵液于4 ℃、8 000 r/min離心20 min，棄沉淀后加入硫酸銨至10%飽和度，4 ℃靜置過夜，冷凍離心（4 ℃、12 000 r/min、10 min），留取上清液備用。將上清液分為等量15份，分別加入不同量的硫酸銨使飽和度達到20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%，4 ℃條件下靜置過夜，冷凍離心，分別收集沉淀和上清液。將沉淀溶于巴比妥鈉-HCl緩沖液中，以纖維蛋白平板法分別測定沉淀和上清液的纖溶酶活性。

1.2.4.2 透析與濃縮

將鹽析后收集的沉淀溶于pH 7.5的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液中，4 ℃、8 000 r/min離心20 min后，將上清液裝入透析袋內，在蒸餾水中于4 ℃充分透析至透析液經BaCl2檢驗無沉淀為止。后將其置于聚乙二醇20 000中濃縮。

1.2.4.3 葡聚糖凝膠層析

將經過透析除鹽濃縮后的粗酶液用葡聚糖凝膠G-75進行層析分離，以磷酸鹽緩沖液（pH 7.8）為洗脫液，每管接洗脫液10滴，檢測收集到的各管中蛋白質和纖溶酶分布情況。

1.2.4.4 纖溶酶的分子質量測定

參照文獻[9]的方法進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，選擇5%濃縮膠、12%分離膠。

1.2.5 纖溶酶的酶學性質研究

1.2.5.1 溫度對纖溶酶活性的影響

將純酶液作適當稀釋后，取10 μL點樣于纖維蛋白平板上，將其置于不同溫度下（25、30、35、37、40、45、50、55、60 ℃）恒溫放置18 h，測量水解圈垂直直徑，比較纖溶酶在不同溫度下的活性。

1.2.5.2 纖溶酶的溫度穩定性

將純酶液作適當稀釋后，分別置于30、40、50、60 ℃水浴鍋中保溫1 h，期間每隔15 min取樣，測定酶的剩余酶活力，確定纖溶酶對溫度的耐受性。

1.2.5.3 pH值對纖溶酶活性的影響

用pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0、11.0的廣泛緩沖液分別與純酶液按體積比1∶1的比例混合，4 ℃放置1 h后，用纖維蛋白平板法測定纖溶酶酶活力，研究pH值對纖溶酶活性的影響。

1.2.5.4 金屬離子對纖溶酶活性的影響

配制含不同金屬離子的鹽溶液：NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、FeCl3、CuCl2、MnCl2。將鹽溶液分別加入純酶液中，使金屬離子的終濃度分別為5、10 mmol/L，并以不加金屬離子的酶液為對照，4 ℃放置1 h后測纖溶酶酶活力，比較金屬離子對纖溶酶活性的影響。

2 結果與分析

2.1 19 L發酵罐實驗

圖1 發酵罐中GZJSI-12-7的生長曲線和產酶曲線Fig.1 Growth and fibrinolytic activity curves of GZJS1-12-7 in 19 L fermenter

對搖瓶最優條件進行19 L發酵罐實驗，每6 h取樣，測其OD600nm光密度和纖溶酶酶活力，結果如圖1所示。菌株在發酵罐中培養時，1～2 h內為延滯期，2 h后進入對數生長期，并在12 h后進入穩定生長期，66 h后則進入衰亡期。由發酵罐中的產酶曲線可以看出，培養6 h后菌株開始產生纖溶酶，并在48 h時達到一個高峰，此后的18 h內纖溶酶產量穩定，可能是由于發酵液中的纖溶酶濃度較高，對菌株產酶產生了反饋抑制所致；66 h后纖溶酶產量又逐漸增加，可能是進入衰亡期后菌體細胞破裂，細胞內的纖溶酶得以釋放，抑或是酶的二次誘導所致；進入78 h后，纖溶酶的產量增加趨于平緩，考慮到經濟效益，選擇78 h作為發酵終點，此時纖溶酶的產量為4 178.39 IU/mL。從菌體生長與產酶的關系來看，在進入對數中后期時纖溶酶開始合成，并且在進入穩定期后繼續合成，屬于部分生長偶聯型[10]。

由圖1中搖瓶和發酵罐中產酶曲線的比較可以看出，發酵罐中的起始產酶時間比搖瓶提前6 h左右，并在9～24 h內纖溶酶產量高于搖瓶，可能是由于在發酵罐中的穩定期比搖瓶提前，生物量在這段時間內多于搖瓶的緣故；30～48 h內，搖瓶和發酵罐中產酶速率均處于較高的水平，纖溶酶產量迅速上升，可能是進入穩定期后纖溶酶的迅速積累；48 h后，搖瓶中的纖溶酶產量開始高于發酵罐，并一直處于領先水平，可能是由于發酵罐中前期原料（底物或碳源）消耗較快，后期相對于搖瓶原料（底物或碳源）匱乏的結果；60～78 h內搖瓶中的纖溶酶產量趨于平穩，之后又緩慢上升并在90 h時產酶達到高峰，為4 847.63 IU/mL，比發酵罐中的產酶高峰推遲了12 h左右。

2.2 硫酸銨分級鹽析

GZJSI-12-7發酵液經不同飽和度硫酸銨鹽析后上清液和沉淀中的纖溶酶酶活力如圖2所示。當硫酸銨飽和度小于35%時，纖溶酶不形成沉淀，酶活力基本存在于上清液中；35%～80%飽和度范圍時，纖溶酶的沉淀量隨硫酸銨飽和度的增加而增加；當硫酸銨飽和度達到80%時，上清液中纖溶酶活力為零，酶基本被沉淀下來；但飽和度大于75%時，沉淀中纖溶酶活力并沒有顯著增加，由于高濃度樣品鹽析存在共沉淀的問題，因此，考慮用35%～75%飽和度的硫酸銨分段鹽析，可以把發酵液中的纖溶酶鹽析沉淀出來，并減少其他雜蛋白的干擾。

圖2 硫酸銨飽和度對纖溶酶鹽析效果的影響Fig.2 Effect of different saturation degrees of ammonium sulfate on salting out of fibrinolytic enzyme

2.3 葡聚糖凝膠層析結果

圖3 葡聚糖凝膠G-75層析各管蛋白質含量和纖溶酶分布Fig.3 Distribution of protein content and plasmin activity by Sephadex G-75 chromatography

由圖3可見，粗酶液經葡聚糖凝膠G-75層析分離后，蛋白質主要分布在6～34管，且在第12管和第28管出現兩個活性峰，其中第12管蛋白質含量最高，達到393.62 μg/mL；纖溶酶主要分布在第6～20管，其中在第12管出現一個峰值。由洗脫曲線還可以看出，纖溶酶酶活力峰基本上與蛋白質濃度的前一個洗脫峰相重疊，纖溶酶集中在6～20管被洗脫出來，與21～34管的雜蛋白分離開。

經分析比較之后，以7～17管的收集液作為純化分離后的酶液，經濃縮后測定蛋白質含量和纖溶酶活性，計算層析分離后酶的各項指標。

2.4 纖溶酶的分子質量

由圖4可知，純化后樣品的電泳圖譜檢測只顯示一條明顯的蛋白條帶，根據分子質量標準蛋白做標準曲線，確定該纖溶酶的分子質量約為30.2 kD，與Agrebi等[11]報道的從解淀粉芽孢桿菌An6發酵液中分離的纖溶酶的分子質量相近。

圖4 純化纖溶酶電泳圖譜Fig.4 Eletrophoresis of purified fibrinolytic enzyme

2.5 纖溶酶的純化倍數與回收率

500 mL發酵液經硫酸銨分級鹽析、Sephadex G-75層析后，各步驟酶的比活力、純化倍數及酶活力回收率如表1所示。

表1 纖溶酶純化效果Table 1 Purification of fibrinolytic enzyme

由表1可知，發酵粗酶液經過一系列的分離純化步驟后，酶的純化倍數為9.84倍，酶活力回收率42.52%，比活力為48 073.193 IU/mg，純化效果明顯。

2.6 纖溶酶的酶學性質

2.6.1 溫度對纖溶酶酶活力的影響結果

圖5 溫度對纖溶酶活性的影響Fig.5 Effect of temperature on the activity of fibrinolytic enzyme

由圖5可知，溫度低于40 ℃時，纖溶酶活力隨著溫度的升高而提高；35～45 ℃的范圍內，纖溶酶酶活力相對較高，并且在40 ℃時活性最大；當溫度高于40 ℃時，酶活力隨著溫度的進一步升高而降低，且當溫度為60 ℃時，酶活力基本上喪失。

2.6.2 纖溶酶的溫度穩定性結果

圖6 纖溶酶的溫度穩定性Fig.6 Effect of temperature on the stability of fibrinolytic enzyme

由圖6可知，該酶在30 ℃時比較穩定，酶活力基本保持不變，40 ℃保溫l h后酶活力損失不大。50 ℃時隨時間延長酶活力逐漸降低，1 h后酶活力損失約40%。60 ℃時隨著保存時間的延長，纖溶酶活力迅速下降，1 h后基本失活，與牛術敏等[12]報道的BS-26菌株纖溶酶熱穩定性一致，說明該纖溶酶的耐熱性不是很好。

2.6.3 pH值對纖溶酶活性的影響結果

圖7 pH值對纖溶酶活性的影響Fig.7 Effect of pH on the activity of fibrinolytic enzyme

由圖7可知，pH 7.0～9.0時，纖溶酶酶活力相對穩定，pH 7.5左右時，酶活力達到最高。pH值低于7.5時，酶活力隨著pH值的增大而提高。pH值高于7.5時，酶活力隨著pH值的增大而減小，pH 10.0后隨著pH值的增大酶活力迅速降低，由此推測該纖溶酶的最適pH值為7.5左右，且該纖溶酶在堿性范圍內的穩定性優于在酸性環境中的穩定性。

2.6.4 金屬離子對纖溶酶活性的影響結果

圖8 金屬離子對纖溶酶活性的影響Fig.8 Effects of metal ions on the activity of fibrinolytic enzyme

由圖8可知，Na+、K+對纖溶酶酶活力的影響不大；Mg2+、Ca2+、Mn2+對纖溶酶酶活力均有較強的激活作用，并且以Mn2+的激活作用最為明顯，但5 mmol/L和10 mmol/L的離子濃度對酶活力的影響差異均不顯著（P＞0.05）；Cu2+和Fe3+則明顯抑制纖溶酶的酶活力，且隨著濃度的增大，抑制作用增強（P＜0.05）。

3 結 論

目前國內外關于纖溶酶類的研究非常活躍，也取得了許多顯著的成果[13-15]，但是這些成果大多局限于實驗室的搖瓶發酵，而搖瓶發酵的條件與發酵罐的發酵條件在一定程度上存在差異，往往存在著“放大效應”，并且由于傳遞因素造成的影響導致搖瓶實驗難以實現精確在線檢測和調控，所以采用發酵罐進行發酵實驗仍是目前生物技術開發和實現產業化的必由之路[16]。本實驗對突變株GZJSI-12-7的搖瓶產纖溶酶最佳條件進行19 L發酵罐實驗，結果表明，78 h后纖溶酶產量基本穩定，達到4 178.39 IU/mL，與文獻相比仍處于較高的產酶水平[17-18]，下一步有望通過對發酵罐中培養基成分和發酵參數的優化及基因工程菌的構建來進一步提高纖溶酶的發酵效價。

經一系列的分離純化手段后獲得了純化的纖溶酶，酶的純化倍數為9.84倍，酶活力回收率42.52%，酶比活力為48 073.193 IU/mg，該比活力與已有文獻相比處于較高的水平[19-21]，可將其用于溶栓藥物的研究。SDS-PAGE電泳結果表明，該酶的分子質量約為30.2 kD。最適溫度和pH值分別為40 ℃、7.5，接近于人體血液的微環境，說明該酶在人體正常生理環境下酶活力穩定，開發為溶栓藥物的潛力巨大。在40 ℃以下酶的穩定性良好，超過50 ℃后酶活力迅速降低，耐熱性較差。金屬離子Mg2+、Ca2+、Mn2+對纖溶酶活性均有較強的激活作用，其中Mn2+的激活作用最強，Cu2+和Fe3+對酶具有明顯的抑制作用，這與Jeong等[22]的研究結果差異較大，而與牛術敏等[12]的研究結果相似。

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Production and Characterization of Fibrinolytic Enzyme from Bacillus amyloliquefaciens in 19 L Fermenter and Investigation of Its Properties

LIU Lin, XIE He*
(College of Life Sciences, Guizhou University, Guiyang 550025, China)

As an extension of our previous fermentation experiments in shake flasks, the objective of this study was to optimize the fermentation conditions for the production of fi brinolytic enzyme by Bacillus amyloliquefaciens GZJSI-12-7 in a 19 L fermenter. The results showed that plasmin activity began to appear after incubation for 6 h and remained constant after 78 h at a level of 4 178.39 IU/mL. The peak of enzyme production occurred about 12 h earlier than in shake flasks. Fibrinolytic enzyme was purified from the fermented liquid medium by bactofugation, ammonium sulfate precipitation, dialysis and Sephadex G-75 gel filtration, with a purification fold of 9.84 and an activity recovery of 42.52%. The specific activity of the purified fibrinolytic enzyme was 48 073.193 IU/mg. Enzymatic characterization showed that the molecular weight of the fibrinolytic enzyme was about 30.2 kD, and its optimum temperature and pH were 40 ℃ and 7.5, respectively. The purified fibrinolytic enzyme was stable blow 40 ℃ but sharply decreased above 50 ℃. The enzymatic activity was markedly catalyzed by Mg2+, Ca2+and Mn2+, but strongly inhibited by Cu2+and Fe3+.

Bacillus amyloliquefaciens; fibrinolytic enzyme; fermentation; purification; characterization

TQ464.8

A

1002-6630（2014）07-0176-05

10.7506/spkx1002-6630-201407035

2013-06-23

劉林（1988—），男，碩士研究生，研究方向為應用微生物學。E-mail：liulin6904@126.com

*通信作者：謝和（1963—），男，副教授，碩士，研究方向為資源微生物學和應用微生物學。E-mail：xieheh@163.com