乳酸乳球菌SQ117在不同溫度和pH值條件下的生長動力學

周 康，魏 君，蔣翠蓮，韓新鋒，劉書亮

（四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014）

乳酸乳球菌SQ117在不同溫度和pH值條件下的生長動力學

周 康，魏 君，蔣翠蓮，韓新鋒，劉書亮

（四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014）

本實驗針對發酵乳制品中分離鑒定得到的乳酸乳球菌SQ117，在不同的溫度和pH值條件下進行其生長動力學的研究，采用以Baranyi模型為基礎在線軟件DMFit建立了一級模型，采用Ratkowsky模型建立了二級模型，最后對模型進行了驗證。結果表明：DMFit在線軟件能很好的擬合實驗所得的生長曲線，是一種簡單可靠的模型軟件，通過一級模型獲得的生長參數在二級模型的建立和驗證中也具有很好的擬合屬性。此外，將預測微生物學的理論應用于以乳酸乳球菌為代表的益生菌，還可以很好地描述其生長。

預測微生物學；DMFit在線軟件；溫度；pH值；乳酸乳球菌

乳酸菌通常被認為是一類有益于人類健康的重要微生物，它的菌體和代謝產物都具有益生作用[1-2]。因而，含有乳酸菌的益生菌產品在食品工業、飼料生產和臨床醫學上都有著廣泛的應用[3-4]。

結合預測微生物學對乳酸菌的生長進行研究，在國內還處于起步階段，在已有的研究報道中，利用預測微生物模型的方法對乳酸菌進行的研究主要是將其視為腐敗菌[5-6]或研究其致死模型[7]，而將其視為益生菌對于其生長動力學模型的研究還未見報道。而在國外，已有很多采用預測微生物學的方式對乳酸菌發酵特性進行研究的報道，一般都通過預測微生物學中常見的一級模型研究其生長特性和代謝特性[8-9]，進而采用二級模型研究環境因素對于其生長和代謝的影響[10]，從而達到模型化和定量化研究益生菌生長和代謝的目的。因此，通過微生物生長動力學的方法對乳酸菌，尤其是一些益生菌進行研究，不僅在理論研究方面十分必要，在實際的應用中也具有很強的指導價值[11]。

本研究以從四川發酵乳制品中分離鑒定得到的乳酸乳球菌SQ117為研究對象，采用以Baranyi模型為基礎的在線軟件DMFit網頁版對該菌在不同溫度和pH值條件下的生長動力學進行研究，同時對所建立的二級模型進行驗證。為預測微生物學的研究范圍提出了新的思路，也為乳酸乳球菌發酵特性研究提供了新的方法。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

菌株SQ117分離自四川本地的發酵乳制品，經生理生化鑒定及分子鑒定為乳酸乳球菌，本實驗室保藏。經37℃活化3次后用于生長動力學實驗。

選用乳酸菌（De Man，Rogosa and Sharpe，MRS）培養基作為微生物生長培養基（g/100 mL）：葡萄糖2、蛋白胨1、牛肉膏1、酵母膏0.5、磷酸氫二鉀0.2、乙酸鈉0.5、檸檬酸氫二銨0.2、硫酸鎂0.058、硫酸錳0.025、吐溫-80 0.1%，pH 6.5。

1.2 方法

1.2.1 生長動力學曲線測定

將活化好的菌株以1%的接種量接種于MRS培養基中培養，選擇適當時間取樣測定其生長動力學曲線。每次實驗取3個稀釋梯度以平板計數法測定活菌數，每個稀釋梯度3個平行。

實驗所選溫度為10、20、30、37 ℃和42 ℃。pH值為2.5、3、4、5和6.2。

1.2.2 模型的建立

1.2.2.1 一級模型的建立

采用以Baranyi模型[12]為基礎的在線軟件DMFit[13]對數據進行擬合，該軟件基于網頁，將復雜的數學建模通過后臺運算完成，并對用戶所提供的試驗數據進行擬合回歸，進而獲得所需的一級模型參數。

1.2.2.2 二級模型的建立

采用Ratkowsky模型對不同溫度（式（1））和pH值（式（2））條件下所獲得的一級模型參數，最大生長速率（μmax）和延滯期（λ）進行二級模型的建立。采用Excel中的規劃求解進行二級模型的建立。

式中：k為μmax/h-1或1/λ/h-1；a、b、c為模型參數；Tmin和Tmax為預測的最小溫度和最大溫度/℃；pHmin為預測的最小pH值。

將一級模型求得的μmax、λ和對應的溫度及pH值變量代入上式中，擬合出模型參數a、b、c、Tmin、Tmax和pHmin[14-15]。

1.2.2.3 模型的驗證

通過判定系數R2，均方誤差（mean square error，MSE），偏差因子（bias factor，Bf）和準確因子（accuracy factor，Af）來進行驗證，公式如下：

式中：μ觀測為實驗所得生長速率/h-1；μ預測為根據模型計算所得生長速率/h-1；n為實驗次數。

通過以Baranyi模型為基礎的在線軟件DMFit對各溫度條件下細胞生長曲線進行一級模型的擬合，可獲得其決定系數R2。R2（0＜R2＜1）越大說明建立的模型與實際測量越接近；MSE（MSE＞0）越小，說明建立的模型與實際測量越接近。

偏差因子（Bf）是描述觀測值所處位置為預測值所構成曲線的上方、下方還是正好在曲線上的參數，同時該值還能度量觀測值與預測值之間存在差距的大小，即該模型結構性誤差的多少。當該值小于1時，即預測值的平均大于觀測值的平均。

準確因子（Af）描述了各觀測值所得到的點與預測值構成的曲線之間的平均距離。值越大說明模型平均準確性越低，當該值為1時說明預觀測與預測完全吻合，當該值為2時說明預測與觀測有兩個單位的不同[16-17]。

2 結果與分析

2.1 不同溫度和pH值條件下乳酸乳球菌的生長曲線和一級模型的建立

圖1 不同溫度下乳酸乳球菌的生長曲線及其一級模型Fig.1 Growth curves and primary models of L. lactis under different temperatures

由圖1可知，乳酸乳球菌SQ117在10 ℃條件下仍然可以緩慢地生長，其生長速率通過模型回歸后為0.097 8 h-1，延滯期為6.6 h。而在37 ℃時其生長速率最快、延滯期最短，反映了該菌在該溫度下的生長優于其他條件。在42 ℃條件下，該菌的生長受到高溫的抑制，生長速率為0.187 4 h-1，較37 ℃時0.346 1 h-1明顯緩慢，最大細胞濃度也低于37 ℃。通過一級模型的擬合，可獲得其決定系數R2均大于0.95，說明該模型和軟件可對生長數據進行良好的擬合。這一結果也于相關文獻報道認為乳酸乳球菌最適生長溫度為37 ℃，并能在45 ℃以下生長[18]，甚至能在50 ℃以下存活是一致的[19]。

由圖2可知，通過不同的pH值對菌株進行實驗發現，pH值為2.5和3時，菌株生長情況基本一致。通過模型擬合得到其生長速率和延滯期分別為0.128 2、0.133 5 h-1和5.61、5.81 h。菌株在pH值為6時生長最迅速，生長速率和延滯期分別為0.342 3 h-1和1.44 h。通過一級模型的擬合，各生長曲線的決定系數R2均高于0.95，說明采用DMFit軟件所建立的模型能對生長曲線進行很好的表述。

此外，在實驗過程中還發現，當pH值為2.5和3時，當培養至穩定期后，其pH值并未像其他較高pH值條件一樣下降，反而升高到了2.88和3.12，其生理狀況與一般乳酸乳球菌生長時產酸降低pH值相異。已有研究者對pH值在發酵過程中的變化進行了一定研究[20-21]，但其在一般環境中和逆境中生長相異的機理仍值得進行進一步的探討。

圖2 不同pH值下乳酸乳球菌的生長曲線及其一級模型Fig.2 Growth curves and primary models of L. lactis under different pH values

2.2 二級模型的建立

圖3 不同溫度和pH值對生長速率和延滯期的影響及二級模型Fig.3 Secondary models describing growth rate and lag phase as a function of temperature and pH value

通過一級模型的擬合，得到不同條件下相應的最大生長速率μmax和延滯期參數λ，對其進行二級模型的擬合。從圖3a、b可以看出，在不同的溫度條件下，菌株的最大生長速率隨著溫度的升高而增加，延滯期隨著溫度的升高而降低。但當溫度超過其最適溫度37 ℃時，其最大生長速率明顯降低，延滯期明顯延長。其二級模型擬合公式分別為：

通過二級模型分別對μmax和λ的擬合可以看出，其預測的最小溫度和最大溫度分別為－12.836、－12.857 ℃和42.338、42.199 ℃，數值之間差異極小，說明模型能夠針對不同的生長參數預測出一定條件下微生物的特定生長特性。

圖3c、d為在不同pH值條件下μmax和λ的二級模型，可以看出μmax隨著pH值的升高而增加，λ隨著pH值的升高而縮短。因而對其進行線性回歸，可得其二級模型擬合公式為：

2.3 模型的驗證

表1 二級模型的驗證Table 1 Validation of the secondary models

為驗證二級模型是否能很好的描述微生物的生長特點，采用了3種常見的驗證參數對數據和模型進行驗證。通過表1可以看出，二級模型回歸所得MSE值在兩種條件下對兩對生長參數的擬合中均小于0.01，體現了模型良好的擬合特性。一般認為Bf值在0.90～1.05的范圍，該模型能夠很好地預測微生物生長速度和生長狀況；Bf值在0.70～0.90或者1.06～1.15范圍，則該模型是可以被接受的；如果Bf值＞1.15或者＜0.70，則說明該模型是失敗的[17]。本文所有的Bf值都在1左右，落入了0.90～1.05的最佳擬合區間。此外，Af值均在1.17附近，也說明了模型良好的擬合特性。

3 結 論

本實驗對自四川本地發酵乳制品中分離鑒定得到的乳酸乳球菌SQ117進行生長動力學研究，建立了其在不同溫度和pH值條件下的一級模型和二級模型，并對模型的擬合性進行了驗證。本實驗采用以Baranyi模型為基礎的在線軟件DMFit對數據進行了擬合，避免了傳統預測微生物進行數學建模時所進行了繁復演算和擬合，為本領域的研究介紹了一種簡單可靠的新方法。通過預測微生物學在益生菌中的研究，可以更加定量地對益生菌所產生的有益代謝產物進行研究，將實驗室數據更有效的用于生產實際中[22]。

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Growth Dynamics of Lactococcus lactis SQ117 under Different Temperatures and pHs

ZHOU Kang, WEI Jun, JIANG Cui-lian, HAN Xin-feng, LIU Shu-liang
(College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

In this study, we used the isolated strain from fermented milk, which was identified as Lactococcus lactis SQ117, to study its dynamic growth under different temperatures and pH values. We used DMFit web-edition, which is based on the Baranyi model, to establish the primary model, and Ratkowsky model was applied for the secondary model. Both models were validated. The results showed that this DMFit software simulated the growth curve with an excellent goodnessof-fit indicating that DMFit is a functional and handy software. Furthermore, we also found that the theory of predictive microbiology had a good potential to describe the growth of lactic acid bacteria.

predictive microbiology; DMFit web-edition; temperature; pH; Lactococcus lactis

TS254

A

1002-6630（2014）07-0192-04

10.7506/spkx1002-6630-201407038

2013-11-26

周康（1983—），男，副教授，博士，研究方向為食品微生物學。E-mail：kang_zhou@163.com