rBTI的制備及其對果蠅壽命的影響

李 嬌，崔曉東，李玉英，馮思思，王轉(zhuǎn)花*

（化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，山西大學生物技術研究所，山西 太原 030006）

rBTI的制備及其對果蠅壽命的影響

李 嬌，崔曉東，李玉英，馮思思，王轉(zhuǎn)花*

（化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，山西大學生物技術研究所，山西 太原 030006）

構(gòu)建含蕎麥胰蛋白酶抑制劑（rBTI）表達質(zhì)粒pExSecI-BTI的工程菌，在100 L發(fā)酵罐中放大發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)熱處理及離子交換層析純化后，獲得rBTI產(chǎn)品，其純度達到95%以上。用含不同質(zhì)量濃度rBTI（0、20、50 μg/mL）的培養(yǎng)基飼養(yǎng)果蠅，并分別檢測果蠅的最高壽命，平均壽命和半數(shù)死亡時間等。初步研究rBTI對果蠅壽命的影響。結(jié)果顯示，rBTI能夠顯著延長果蠅的壽命。在實驗劑量范圍內(nèi)，果蠅的壽命與rBTI質(zhì)量濃度呈現(xiàn)正相關。抗氧化酶活性檢測發(fā)現(xiàn)，實驗組果蠅體內(nèi)的SOD和CAT活性均顯著升高。rBTI延緩果蠅衰老的作用可能是通過刺激機體的氧化應激能力來實現(xiàn)的。

蕎麥胰蛋白酶抑制劑；果蠅；壽命；抗氧化作用

蕎麥是蓼科蕎麥屬（Fagopyrum）作物，在世界各地廣泛種植，主要有甜蕎麥（common buckwheat）和苦蕎麥（tartary buckwheat）兩個栽培種[1]。近年來，醫(yī)學及營養(yǎng)學等研究表明，蕎麥特別是苦蕎麥，不僅營養(yǎng)成分豐富、營養(yǎng)價值高，而且還含有其他糧食作物所缺乏或不具有的特種微量元素及藥用成分，這些物質(zhì)對現(xiàn)代“文明病”及幾乎所有中老年心腦血管疾病有很好的預防和治療功能[2]。此外，蕎麥蛋白質(zhì)的生理功能也逐漸引起許多學者的關注，如阻止7,12-二甲苯蒽誘發(fā)的乳腺癌[3]、抑制1,2-二甲阱誘發(fā)的大腸癌[4]、抑制人乳腺癌細胞株Bcap37細胞增殖[5]等。因此，蕎麥也被認為是預防癌癥的保健食品，受到各國科學家的重視。蕎麥胰蛋白酶抑制劑（buckwheat trypsin inhibitor，BTI）是由69個氨基酸組成，分子質(zhì)量為7.9 kD的小分子蛋白，屬于Potato I型抑制劑家族，該抑制劑對胰蛋白酶有特異性抑制作用[6]，并且對多種腫瘤細胞表現(xiàn)出顯著的增殖抑制作用[7-8]和誘導細胞自噬的功能[9]，目前已成為醫(yī)藥及食品科學領域的研究熱點。

近期研究報道，雷帕霉素誘導的細胞自噬在早期有助于延緩果蠅衰老[10]，一些植物源生物活性物質(zhì)如槲皮素、白藜蘆醇等也被報道能夠延長線蟲的壽命[11-12]，但有關BTI在抗衰老方面的研究還未見報道。為了揭示BTI對機體衰老的影響，本實驗通過基因工程的方法，構(gòu)建了包含蛋白酶抑制劑BTI基因的工程菌，通過實驗室放大發(fā)酵、純化等制備重組蕎麥胰蛋白酶抑制劑（recombinant buckwheat trypsin inhibitor，rBTI），并研究了其對果蠅壽命的影響，探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

工程菌E.coli BL21（DE3）- pExSec I-BTI由本實驗室構(gòu)建保存；野生型黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）由山西大學分子與遺傳實驗室提供；SOD和CAT試劑盒由南京建成生物工程研究所研制；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

Lx800酶標儀 美國寶特Bio-Tek公司；S-450D超聲波細胞破碎儀 美國Branson公司；?KTA Explorer 蛋白分析純化系統(tǒng) 美國General Electric公司；GUJS-100 -發(fā)酵罐（100 L） 中國浙江東方生物技術公司。

1.3 方法

1.3.1 rBTI的發(fā)酵制備

1.3.1.1 基因工程菌的發(fā)酵

從超低溫冰箱中取出保存的E.coli BL21（DE3）-pExSec I-BTI工程菌，待融化后取出10 μL，加入90 μL LB培養(yǎng)基，混勻，在LB平板（含25 μg/mL Kan）劃線，37℃恒溫培養(yǎng)12 h，挑取單菌落于5mL含30 μg/mL Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，至OD600nm為0.8，作為一級種子。將其按1%接種量轉(zhuǎn)接到500 mL（Kan質(zhì)量濃度為25 μg/mL）液體LB培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)6 h，培養(yǎng)至OD600nm為2左右，作為二級種子備用。采用100 L發(fā)酵罐，按0.7的裝料系數(shù)加入培養(yǎng)基，實罐121℃，高壓滅菌20 min（葡萄糖和磷酸鹽分開單獨滅菌）。待培養(yǎng)基溫度降為室溫，控制自動發(fā)酵罐溫度在37℃，將培養(yǎng)基的pH值用NH3?H2O調(diào)至7.3。加入二級種子，并根據(jù)溶氧值不斷調(diào)整通氣流量和攪拌轉(zhuǎn)速，控制溶氧10%以上。最大轉(zhuǎn)速500 r/min。每1 h測OD600nm、培養(yǎng)基殘?zhí)恰埖浚岳谙乱徊秸T導。當OD600nm達到10左右（對數(shù)中后期），階段式流加補料培養(yǎng)基，控制殘?zhí)呛坎坏陀?～5 g，殘氮含量不低1～2 g。1 h后加入誘導劑IPTG，從加入誘導劑后每隔1 h取樣電泳檢測。加入IPTG誘導劑4 h后，結(jié)束發(fā)酵。培養(yǎng)基中還原糖及NH4+含量測定參照文獻[13-14]進行。發(fā)酵菌體破碎后，分別在60～90℃條件下進行熱處理，12 000 r/min離心，分離上清液和沉淀，沉淀用8 mol/L尿素溶解后，分別進行電泳分析。

1.3.1.2 rBTI的純化

發(fā)酵結(jié)束后，離心收集菌體，超聲液將菌體重懸，再次離心，洗去菌體表面殘留的培養(yǎng)基，收集菌體進行稱重。將菌體用超聲液重懸后，冰浴條件下, 超聲波破碎菌體，直至菌體懸浮液由黏稠變?yōu)橥噶痢Ｆ扑榈木海?jīng)過60～90℃處理20 min，12 000 r/min離心，分離上清和沉淀，分別進行電泳分析，確定最佳熱處理條件。將菌液在確定最佳熱處理對應溫度的水浴中熱處理20 min，12 000 r/min離心10 min，除去沉淀。將上步收集的上清，上樣于Resource? Q在?KTATMExplore進行初步分離。平衡緩沖液為20 mmol/L，pH 7.5的Tris-HCl緩沖液，洗脫液為20 mmol/L Tris-HCl（內(nèi)含0.5 mol/L NaCl）緩沖液。將收集的洗脫液用脫鹽柱除去多余的NaCl，收集的樣品進行SDS-PAGE分析。

1.3.2 rBTI的抗衰老研究

1.3.2.1 rBTI對果蠅壽命的影響

收集4 h內(nèi)新羽化的成蟲，乙醚麻醉，取雌、雄果蠅各320只，隨機分為對照組和兩個劑量用藥組，每組雌雄各60只。對照組普通培養(yǎng)基飼養(yǎng)，實驗組分別用含終質(zhì)量濃度為20 g/mL和50 g/mL rBTI的培養(yǎng)基飼養(yǎng)。在25℃、相對濕度50%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，飼喂過程中，每3 d更換新鮮培養(yǎng)基，在用藥20 d后每天對各組死亡果蠅進行統(tǒng)計，直至全部死亡，計算果蠅半數(shù)死亡時間、最高壽命及平均壽命[15-16]。

1.3.2.2 rBTI對果蠅SOD和CAT活性的影響

按照1.3.2.1節(jié)果蠅培養(yǎng)的方法，在給藥rBTI 20 d后將果蠅進行麻醉致死，稱質(zhì)量。生理鹽水洗去殘留培養(yǎng)基，用吸水紙吸干。按1∶10（m/V）加磷酸緩沖（PBS）溶液。用玻璃勻漿器在冰浴條件下將果蠅進行勻漿，將勻漿液4℃、2 500 r/min離心20 min，取上清，按SOD和CAT檢測試劑盒說明檢測酶活性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 rBTI的發(fā)酵制備

由圖1可知，加熱處理可除去大部分變性的雜蛋白（泳道4、6、8、10）。當處理溫度為80℃時，rBTI大部分以可溶的方式存在于上清液中，占總含量的90%以上（泳道7）。80℃處理（泳道7）和90℃處理（泳道9）效果相當，因此，選擇80℃熱處理20 min，作為rBTI純化前的預處理。

將經(jīng)80℃加熱處理，離心得到的上清液，用陰離子交換層析和凝膠過濾進一步分離純化后，收集的樣品經(jīng)Tricine-SDS-PAGE進行純度檢測。結(jié)果顯示，通過兩步層析分離獲得的rBTI的純度達到95%以上，電泳結(jié)果顯示單一條帶，無二聚體等出現(xiàn)，與預期結(jié)果一致（圖2）。

圖2 rBTI的分離純化及電泳檢測Fig.2 Analysis of rBTI by size exclusion chromatography and Tricine-SDS-PAGE

2.2 果蠅壽命的檢測

由圖3可知，rBTI能夠顯著延長果蠅的壽命，并且呈現(xiàn)一定的質(zhì)量濃度依賴性。當rBTI的質(zhì)量濃度為20 μg/mL時，雌性果蠅壽命延長了19.28%，雄性果蠅壽命延長了28.50%；當rBTI質(zhì)量濃度為50 μg/mL時，雌性果蠅壽命延長了30.50%，雄性果蠅壽命延長了35.00%。此外，雌性和雄性果蠅的半數(shù)死亡時間和最高壽命都有明顯延長（表 1）。表明rBTI具有延緩果蠅衰老的作用。同時也發(fā)現(xiàn)，對照組和樣品組，雌性果蠅的平均壽命及最高壽命均高于雄性果蠅，但飼用rBTI后雄性果蠅的壽命延長幅度要高于雌性果蠅（表1），推測rBTI對雄性果蠅的抗衰老作用可能更為明顯。

圖3 rBTI對果蠅壽命的影響Fig.3 Effect of rBTI on the lifespan of fruit flies

表1 rBTI對果蠅壽命的影響Table 1 Effect of rBTI on the lifespan of fruit flies(x ±s

表1 rBTI對果蠅壽命的影響Table 1 Effect of rBTI on the lifespan of fruit flies(x ±s

組別半數(shù)死亡時間/d平均壽命/d最高壽命/d雌雄雌雄雌雄空白對照454047.20±5.3340.30±3.655547 20 μg/mL rBTI545056.30±4.0351.80±3.856258 50 μg/mL rBTI605561.60±3.7256.90±3.576763

2.3 rBTI對果蠅SOD和CAT活性的影響

圖4 rBTI 對果蠅體內(nèi)SOD和CAT活性的影響Fig.4 Effect of rBTI on SOD and CAT activities in fruit flies

用含有rBTI（20、50 μg/mL）的培養(yǎng)基培養(yǎng)果蠅20 d后，檢測其SOD和CAT的活性。結(jié)果表明，與對照組相比，果蠅體內(nèi)的SOD和CAT的活性均有所提高，且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴效應（圖4）。當rBTI的質(zhì)量濃度為50 μg/mL時，對果蠅體內(nèi)SOD和CAT活性影響最為明顯，雌性果蠅體內(nèi)SOD的活性比對照組升高了27.7%（分別為99.98、78.31 U/g pro），CAT活性升高了30.9%（分別為749.54、572.80 U/mg pro）；而雄性果蠅體內(nèi)SOD活性升高了33.2%（分別為90.33、67.8 U/g pro），CAT活性升高35.3%（分別為651.10、481.21 U/mg pro）。這些結(jié)果表明，rBTI對果蠅體內(nèi)的兩種主要抗氧化酶活性有一定的影響，可提高其抗氧化防御系統(tǒng)清除自由基的能力。該結(jié)果與前述果蠅壽命檢測實驗的結(jié)果相一致。rBTI用藥后雄性果蠅體內(nèi)SOD和CAT活性提高的幅度要大于雌性果蠅，這可能是雄性果蠅壽命的延長幅度大于雌性的原因。

3 討 論

蕎麥作為一種藥食同源的小雜糧作物，含有諸多生物活性物質(zhì)，在食品和醫(yī)藥學領域受到普遍關注。目前，已有多種含有蕎麥活性成分的功能性食品面世，為改善心腦血管疾病患者的飲食及健康狀況提供了保障。另外，其中的活性多肽和功能蛋白的作用也引起人們的關注[17]。本實驗采用pExSecI-BTI表達載體，通過優(yōu)化發(fā)酵及純化條件，經(jīng)原核表達、發(fā)酵、純化制備獲得了純度大于95%的功能蛋白rBTI。經(jīng)計算，本研究中，在100 L發(fā)酵液中，可獲得15.4 g的高純度rBTI，且實驗中利用rBTI耐熱的性質(zhì)，對發(fā)酵獲得的粗品先進行加熱處理，除去大部分雜蛋白，減少了純化步驟，提高了純化效率，獲得的產(chǎn)品在Tricine-SDS-PAGE中顯示單一條帶，該加熱處理對一些耐熱的蛋白質(zhì)及多肽的提取同樣有效。本實驗建立的方法不僅為研究rBTI的生物學功能提供了基礎，也為其他相關蛋白的大規(guī)模制備和純化提供了借鑒的方法。此外，本研究選用的表達載體pExSecI，其基因型是Kanr、MCS、T7啟動子、M13復制區(qū)，含有BamH I、Nde I酶切位點，無任何標簽序列，在E.coliBL21（DE3）中能穩(wěn)定表達，表達產(chǎn)物以可溶形式存在，純化后得到的rBTI純度高，為rBTI及相關基因工程產(chǎn)品的規(guī)模化制備提供了方法和依據(jù)。

通常，機體衰老與體內(nèi)大量積累O2－·、H2O2、·OH等自由基有關，這些自由基可破壞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸分子的結(jié)構(gòu)，使細胞成分積累性氧化損傷[18]。除此自由基衰老理論外，另一普遍被接受的理論是生活速率衰老理論，該理論強調(diào)，決定有機體壽命的是在細胞水平產(chǎn)生和利用能量的效率，能量利用效率的提高能夠減緩機體衰老[19]。本實驗為評價rBTI的抗衰老功效，選取模式生物果蠅作為對象，這是因為果蠅具有與人類相似的抗衰老途徑，能夠快速評價抗衰老作用并研究作用機制。實驗結(jié)果表明，rBTI能夠延緩果蠅的衰老，同時可提高果蠅體內(nèi)的抗氧化酶SOD、CAT的活性，而SOD和CAT是機體抗氧化防御系統(tǒng)的主要成分[20]，由此推斷，rBTI延緩果蠅衰老的作用可能依賴于自由基衰老理論，即rBTI提高了果蠅體內(nèi)的抗氧化物酶活性，增強了果蠅機體的抗氧化防御能力，提高了對自由基的清除能力，從而起到了延緩衰老的效果。有關rBTI在抗衰老、改善機體的抗氧化防御系統(tǒng)，清除自由基等方面的內(nèi)容有待進一步深入研究。

[1] 王育紅, 李穎. 蕎麥的應用現(xiàn)狀及前景[J]. 食品科學, 2004, 25(10): 388-391.

[2] 張玲, 高飛虎, 高倫江, 等. 蕎麥營養(yǎng)功能及其利用研究進展[J]. 南方農(nóng)業(yè), 2011, 5(11): 74-80.

[3] KAYASHITA J, SHIMAOKA I, NAKAJOH M, et al. Consumption of a buckwheat protein extract retards 7,12-dimethylbenz [alpha]-racene inducedmammary carcinogenesis in rats[J]. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 1999, 63(10): 1837-1839.

[4] LIU Zhihe, ISHIKAWA W, HUANG Xuxin, et al. A buckwheat protein product suppresses 1,2-dimethylhydrazine-induced colon carcinogen esis in rats by reducing cell proliferation[J]. The Journal of Nutrition, 2001, 131(6): 1850-1853.

[5] 郭曉娜, 姚惠源. 苦蕎麥抗腫瘤蛋白的分離純化及結(jié)構(gòu)分析[J]. 食品科學, 2007, 28(7): 462-465.

[6] 崔曉東, 李玉英, 李晨, 等. Potato I型蛋白酶抑制劑 rBTI及其突變體的表達、純化和活性研究[J]. 中國生物化學與分子生物學報, 2012, 28(4): 346-351.

[7] 李芳, 李玉英, 白崇智, 等. 重組蕎麥胰蛋白酶抑制劑對人肝癌細胞的凋亡及半胱氨酸蛋白酶活性的影響[J]. 中國生物化學與分子生物學報, 2009, 25(2): 182-187.

[8] 田欣, 李晨, 李玉英, 等. 野生型和突變型蕎麥蛋白酶抑制劑的活性比較及抗腫瘤功能分析[J]. 生物化學與生物物理進展, 2010, 37(6): 654-661.

[9] 崔曉東, 王轉(zhuǎn)花. 一種蕎麥胰蛋白酶抑制劑的用途: 中國, 201210200431.3[P]. 2013-07-10.

[10] BJEDOV I, TOIVONEN J M, KERR F, et al. Mechanisms of life span extension by rapamycin in the fruit fly Drosophila melanogaster[J]. Cell Metabolism, 2010, 11(1): 35-46.

[11] ANDREAS K, NKWONKAM C G, ZURAWSKI R F, et al. Investigations of protective effects of the flavonoids quercetinand rutin on stress resistance in the model organism Caenorhabditis elegans[J]. Toxicology, 2007, 234(1/2): 113-123.

[12] HECTOR K L, LAGISZ M, NAKAGAWA S. The effect of resveratrol on longevity across species: a meta-analysis[J]. Biology Letters, 2012, 8(5): 790-793.

[13] 趙凱, 許鵬舉, 谷廣燁, 等. 3, 5- 二硝基水楊酸比色法測定還原糖含量的研究[J]. 食品科學, 2008, 29(8): 534-536.

[14] 趙良啟, 韓廣業(yè). 靛酚藍比色法的改進及其在發(fā)酵過程中的應用[J].山西大學學報, 1999, 22(3): 265-269.

[15] 田金強, 朱克瑞, 李新明, 等. 阿魏菇多糖的抗氧化功能及其對果蠅壽命的影響[J]. 食品科學, 2006, 27(4): 223-225.

[16] 徐幸蓮, 陳伯祥, 莊蘇. 烏骨雞對延緩果蠅衰老作用的研究[J]. 食品科學, 2000, 21(12): 134-136.

[17] 李玉英, 郭慧, 崔曉東, 等. 蕎麥rBTI-2的表達及其對腫瘤細胞的生長抑制作用[J]. 中國細胞生物學學報, 2011, 33(7): 759-765.

[18] MARKESBRY W R, LOVELL M A. Four-hydroxynonenal, a product of lipid peroxidation, is increased in the brain in Alzheimers disease[J]. Neurobiology of Aging, 1998, 19(1): 33-36.

[19] van RAAMSDONK J M, MENG Y, CAMP D, et al. Decreased energy metabolism extends lifespan in caenorhabditis elegans without reducing oxidative damage[J]. Genetics, 2010, 185: 559-571.

[20] LI Y M, CHAN H Y, HUANG Yu, et al. Green tea catechins upregulate superoxide dismutase and catalase in fruit flies[J]. Molecular Nutrition & Food Research, 2007, 51(7): 546-554.

Preparation of Recombinant Buckwheat Trypsin Inhibitor and Its Effect on the Lifespan of Drosophila melanogaster

LI Jiao, CUI Xiao-dong, LI Yu-ying, FENG Si-si, WANG Zhuan-hua*
(Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering, Ministry of Education, Institute of Biotechnology, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)

E. coli BL21(DE3) containing recombinant plasmid pExSecI buckwheat trypsin inhibitor (BTI) was constructed by gene cloning, and was cultured in a 100 L fermentor for large-scale fermentation. The fermentation products were purified by heat treatment and ion exchange chromatography. The purity of recombinant BTI obtained was greater than 95% after a series of optimization steps. Then fruit flies were fed with a medium containing different concentrations of rBTI (0, 20, 50 μg/mL). The maximum lifespan, average lifespan and lethal dose-50 time were tested, respectively. The effect of the purified rBTI on he fruit fly’s lifespan was studied. The results showed that rBTI significantly extended the lifespan of fruit fly in a dose-dependent way within the range of experimental doses. At the same time, the activities of superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) were found to be significantly increased in the fruit flies of the experimental group. The preliminary studies indicate that the anti-aging effect of rBTI on fruit flies may be achieved by increasing its anti-oxidative stress ability.

buckwheat trypsin inhibitor; Drosophila melanogaster; lifespan; antioxidation

Q599

A

1002-6630（2014）07-0202-04

10.7506/spkx1002-6630-201407040

2013-10-14

國家自然科學基金面上項目（31171659）；國家自然科學基金青年科學基金項目（31300653）；太原市科技攻關計劃項目（100622）

李嬌（1989—），女，碩士研究生，研究方向為蛋白質(zhì)化學與工程。E-mail：976443538@qq.com

*通信作者：王轉(zhuǎn)花（1956—），女，教授，博士，研究方向為蛋白質(zhì)工程與生物活性物質(zhì)。E-mail：zhwang@sxu.edu.cn