基層醫院呼吸道合胞病毒檢測方法的篩選

許 琴 林素香 鄭水華

珠海第二人民醫院檢驗科，廣東珠海 519000

呼吸道合胞病毒是嬰幼兒呼吸道嚴重感染的最重要的病毒病原之一，流行面廣、發病率高[1-2]。目前尚無特異預防措施，RSV感染及其預后是嚴重的公共健康問題?；鶎俞t院迫切需要一種快速、可靠、易推廣的RSV早期診斷方法。本研究選擇50例PCR-熒光探針和臨床確診的RSV感染患兒鼻咽分泌物，分別用雙抗體夾心ELISA、直接免疫熒光法(DFA)、免疫層析金標法（ICA）、橋聯酶標法(APAAP)檢測呼吸道RSV抗原，為基層醫院篩選快速、準確、方便的檢測方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2014年3-4月珠海第二人民醫院住院患兒50例 （男28、女 22 例）,年齡（0～12 歲），經 PCR-熒光探針和臨床確診的RSV感染患兒的鼻咽分泌物。

1.2 試劑與儀器

D3UltraTMDFA試劑盒(Quidel)、雙抗體ELISA試劑盒（北京科斯塔）、單克隆抗體橋聯酶標診斷試劑盒（上海瑞齊）、RSV金標免疫法（深圳賽爾）、熒光顯微鏡（Olympus）。

1.3 方法

1.3.1 DFA法檢測RSV病毒抗原 患兒鼻咽分泌物1 mL，加PBS，吸管吹打，2000rpm離心棄上清、吸取細胞懸液25 μL，點于帶孔玻片丙酮固定。滴加熒光標記的抗體37℃30 min，洗片后封片，熒光顯微鏡觀察。

1.3.2 金標法ICA法 向反應板標本孔滴加標本,15 min后觀察反應板孔中C端和T端有無紅色圓斑。

1.3.3 雙抗體夾心ELISA法 取試劑盒包被板每孔滴加稀釋液和標本,陰陽對照孔分別加入陰、陽對照液，置37℃40min，洗滌甩干加酶標記物,置37℃20 min,洗滌甩干加底物液。酶標儀450nm波長比色,空白孔調零，標本OD值與陰性對照孔OD值比值≥2.1為陽性。

1.3.4 堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶橋聯酶標法 (APAAP)樣本加PBS吹打離心棄上清，細胞懸液加封閉液后沖洗；加一抗后沖洗；加二抗后沖洗；加底物液5g/L甲基綠負染沖洗，普通光學鏡下(10×40)鏡檢。

1.4 統計學處理

采用SPSS 10.0軟件,對計數資料進行χ2檢驗,比較各方法間陽性率的差別。

2 結果

DFA法：熒光顯微鏡下細胞內呈現黃綠色熒光為陽性，未發生抗原抗體特異性反應的細胞，被Evans藍染成紅色。放大200倍時，在視野中找到≥2個陽性細胞，判為標本陽性，50例標本中44為陽性，RSV陽性檢出率為88%。ICA法：反應板孔C端和T端均出現紅色圓斑為RSV陽性，反應板孔C端出現紅色圓斑，T端不出現紅色圓斑為RSV陰性,反應板孔C端或C端、T端均不出現紅色圓斑為失效，50例標本中42為陽性，陽性率84%。雙抗體夾心ELISA法：50例鼻咽分泌物陽性20例，陽性率40%。APAAP法：普通光學顯微鏡下，RSV感染的鼻咽分泌物纖毛柱狀上皮細胞胞質和膜可特異地染成玫瑰紅色，核呈淡藍色或無色，≥3個以上典型著色細胞判為陽性，50例標本中40為陽性，陽性率80%。見表1。

表1 四種快速檢測RSV陽性率(%)比較

3 討論

呼吸道合胞病毒是引起嬰幼兒下呼吸道感染最常見的病毒,這種病毒性肺炎也是嬰兒猝死的病因之一[3-4]。目前臨床常用檢測RSV感染的方法有分離培養鑒定、間接熒光免疫法、直接熒光免疫法、橋聯酶標免疫法、核酸檢測、ELISA法。病毒分離培養雖是金標法，但費時、實驗要求及成本高，不易獲得成功，不適合臨床早期診斷和應急診斷需要。核酸雜交、RT-PCR技術檢測RSA感染，敏感性、特異性高，能進行微量檢測及RSA分型（A、B亞型），但實驗條件要求嚴格，成本高，難以在基層醫院普及。故本研究用DFA、ICA、APAAP、雙抗體夾心ELISA四種方法檢測RSV抗原，以篩選快速、準確、方便的適合基層醫院檢測方法。

標本選自2014年3—4月確診RSV感染小兒鼻咽分泌物。DFA、ICA、APAAP、雙抗體夾心ELISA四種方法檢測出的RSV陽性率依次為 88%(44/50)、82%(42/50)、80%(40/50)、40%(20/50)。經統計學處理，前3種方法,無顯著差異;雙抗體夾心ELISA法與前三種方法相比，RSV陽性檢出率明顯低于其它三種檢驗方法,差異有顯著性。RSV成熟時,RSV病毒大部分在細胞內[5]。雙抗體夾心ELISA法檢測的是細胞外的病毒蛋白,當濃度低于ELISA法檢測蛋白靈敏度的下限時檢測不到病毒蛋白；另感染RSV后,需要一定的時間才能產生RSV-Ag,且RSV-Ag效價低也直接影響檢測，因此該方法易造成陽性樣本漏檢。Koetz報道,ELISA檢測RSV病毒其靈敏度不如免疫熒光技術，與本研究結果相符。ELISA法雖然易掌握，快速，但陽性率低，不適合臨床應用。DFA法檢測的是細胞內的病毒蛋白,故病毒蛋白的質量濃度相對較高,此外DFA靈敏度高，能檢出病毒的最低濃度為1.0PFU，陽性檢出率88%為四種方法中最高。與其它三種方法相比，直接免疫熒光法靈敏度、特異性高[6]、操作簡便，更符合基層醫院的快速、簡單、準確的診斷要求。國外對呼吸道病毒的檢測大多采用DFA檢測[7]。金標ICA法陽性率為84%，與DFA法相比，兩種檢測方法靈敏度無統計學意義,與文獻報道一致[8]。金標法操作簡便快速,30min可出結果,不需要貴重儀器,故金標法可作為基層醫院門診篩查。APAAP法在普通光學顯微鏡下可辨認，基層APAAP可開展,但與DFA相比，操作步驟多，易出現非特異性著色，時間長（3～4 h）。

綜上所述，ELISA靈敏性、操作性最差，不適合臨床推廣使用；APAAP法步驟多，耗時長，不宜推廣；金標法靈敏度較高，可作為基層醫院門診篩查；直接免疫熒光法簡單、快速、敏感度和特異性高，是基層醫院RSV感染早期診斷的優選方法，適合基層醫院推廣應用。

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