大鼠腦損傷后血漿E T-1的含量變化與損傷時間的關系

王 茝

山西醫科大學法醫學院，山西太原 030001

隨著經濟、社會、及交通等各方面的發展，腦損傷的發生率呈不斷上升趨勢，腦損傷也成為國內外法醫學研究的主要死因之一。內皮素（Endothelin）是上世紀80年代由日本學者Yanagisaw等[1]從豬主動脈內皮細胞分離出的一種活性肽，是迄今研究人體內最強的縮血管物質之一。ET-1是內皮素家族中含量最多而且功能最主要的一種。本實驗參照Feeney's法建立大鼠腦損傷模型，應用酶聯免疫法檢測大鼠腦損傷后不同時間點ET-1的表達規律。為法醫學腦損傷的推斷及研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

2013年11月—12月，選取健康成年SD大鼠40只，雌雄不限，體重250g～300g,隨機分為正常組，假損傷對照組和腦損傷組1h、6h、24h、48h、3d、7d 共 8 組，每組 5 只。

1.2 動物模型制備

參照Feeney's法[2]建立大鼠腦損傷模型，大鼠稱重后，以10%水合氯醛進行腹腔麻醉，采取俯臥位固定于打擊臺上，將大鼠頂枕部常規消毒備皮，于正中線處將頭皮切約4 cm切口，剝離骨膜，以人字縫前3 mm，顱骨正中線旁3 mm處用骨鉆鉆一直徑約為5 mm的圓形骨窗，使硬腦膜充分暴露，并保持完好，自制一打擊墊放入骨窗，模擬自由落體打擊裝置，以50 g砝碼沿導管于40 cm高處落下打擊骨窗處，觀察片刻后以骨臘封閉骨窗，縫合頭皮。正常組不做任何處理，對照組SD大鼠僅做鉆孔處理，不做自由落體打擊，不致腦損傷。遂將大鼠置于室內安靜、清潔的鼠籠中進行正常飼養，然后依據實驗設計損傷時間點取材。

1.3 ET-1的測定

腦損傷組按損傷時間后 1h、6h、24h、48h、3d及 7d時間點進行10%水合氯醛麻醉，采血4 mL,將4 mL血液標本加入10%EDTA 60 uL和 80 uL抑肽酶,混合20 min后，3000轉/分離心 20 min，分離血漿后，嚴格按照（ET-1）ELISA試劑盒說明書操作，測血漿內皮素-1含量。

1.4 數據統計學分析

本實驗全部數據采用SPSS統計軟件處理分析，計量數據結果描述均以均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗進行統計分析。P<0.05表示有統計學意義。

2 結果

腦損傷組大鼠血漿ET-1含量在損傷后1h與假損傷對照組相比明顯升高，有統計學意義(P<0.05)。其在損傷后24h內呈持續升高狀態。24h血漿ET-1含量水平達到高峰，隨后逐漸下降，3d時仍高于對照組，并且有統計學意義（P<0.05）.至7d時，血漿ET-1含量趨于正常組，無統計學意義（P>0.05）。見表1。

表1 ELISA法測定正常組，假損傷對照組及損傷后不同時間的血漿ET-1 含量（±s）The ET-1 level in plasma between each groups by ELISA

表1 ELISA法測定正常組，假損傷對照組及損傷后不同時間的血漿ET-1 含量（±s）The ET-1 level in plasma between each groups by ELISA

注：與對照組比較有統計學意義，*P<0.05。

組別（n=5） 血漿 ET-1（pg/mL）正常組假損傷對照組損傷后1h組損傷后6h組損傷后24h組損傷后48h組損傷后3d組損傷后7d組40.16±1.47 46.24±2.93 65.68±3.02*80.49±8.26*102.29±15.82*68.46±10.24*56.63±5.48*43.22±2.05

3 討論

ET是由21種氨基酸組成的活性肽物質，是目前已知體內最強的縮血管物質。ET-1是唯一存在于血管內皮細胞的內皮素。ET-1是內皮素家族中含量最多而且功能最主要的一種。目前，還沒有研究發現在生理條件下內皮細胞可以釋放ET，但在化學或是機械刺激下對ET的合成有誘導作用。

本實驗結果顯示大鼠于腦損傷1h后ET-1表達即明顯增強，24h達到高峰，48h開始下降，提示ET-1參與了顱腦損傷的過程。顱腦損傷后ET-1含量增高的機制尚不完全明確，其原因可能有：①腦損傷后引發機體產生應激反應，使腎上腺素分泌增加，誘導ET-1的合成[3]。②腦損傷后血管內皮受損，刺激血小板粘附，血栓形成，紅細胞破壞釋放出氧合血紅蛋白，可刺激血管內皮產生ET-1[4]。③腦損傷后，引發腦水腫，顱內壓升高，腦組織血流灌注量降低，腦缺血，缺氧狀態下可誘發血管內皮釋放ET-1[5]。④中樞神經系統應激反應，內包括內皮細胞，神經元，膠質細胞等釋放ET-1。⑤腦損傷后，局部缺血，或是出血，凝血酶增加，也可導致ET-1的釋放。⑥機體應激反應下，交感神經興奮使腎上腺皮質激素分泌增加刺激外周血管內皮細胞釋放ET-1。本實驗結果與段國賢等[6]研究內皮素-1在大鼠彌漫性腦損傷時的改變結果有所差異，其模型鼠傷后3h血漿ET-1含量增加，6h達高峰，24h開始下降。差異的存在可能與實驗標本的選取、損傷方式的不同及損傷程度有關。

近年來，有關ET-1的研究有很多，但ET-1與損傷時間之間的關聯性研究卻鮮有涉及，本實驗結果顯示隨著損傷時間的不同，ET-1含量的表達程度不同，表明血漿ET-1的表達與損傷時間有一定關聯性。為法醫實踐工作中損傷時間的推斷提供了參考依據。但由于動物實驗存在多種不可抗拒因素和樣本的局限性，統計學上可能存在誤差。所以與實際運用還存在著差距。在今后的研究中，應結合臨床，以及腦損傷程度的分級來加以研究，總之，血漿ET-1用于法醫學實踐中，還有待進一步的探索和研究。

[1]Yanagisawa M，Kurihara H，Kimura S，et al.A novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelial cell[J].Nature，1988,332:411-415.

[2]Feeney DM,Boyeson MG,Linn RT,et al.Responses to cortical injury Methodology and local effect of contusions in the rat[J].Brain Res,1981,211:67-77.

[3]Miyauchi T,Yanagisawa M,Tomizawa T，et al.Increased plasma concentrations of ET-1 and big ET-1 in acute myocardial plasma infarction[J].Lancet，1989（2）:53-54.

[4]陶進,李真保,許安定.血漿內皮素的變化與顱腦損傷程度及預后關系[J].急診醫學，2009,9(2):101-102.

[5]Highsmith RF,Pang DC,Rappoport RM,et al.Endothelia cell-derived vasoconstrictors,mechanism of action in vascular smooth muscle.[J].Cardiovasc Pharmacol，1989，13(5):36-44.

[6]段國賢，周開順.內皮素-1在大鼠彌漫性腦損傷時的改變和意義.[J]臨床神經病學雜志，2003，16(3):179-180.