真菌毒素人工抗原制備方法研究進展

吳春生，馬 良,2,3,*，胡媛媛，張宇昊,2,3

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.農業部農產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室（重慶），重慶 400716；3.重慶市特色食 品工程技術研究中心，重慶 400716）

真菌毒素人工抗原制備方法研究進展

吳春生1，馬 良1,2,3,*，胡媛媛1，張宇昊1,2,3

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.農業部農產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室（重慶），重慶 400716；3.重慶市特色食 品工程技術研究中心，重慶 400716）

基于免疫原理的酶聯免疫吸附技術和金標免疫層析技術等是目前真菌毒素主要的快速檢測技術。人工完全抗原的制備和抗體的性質是免疫快速檢測技術中最關鍵的因素。本文對我國糧油產品危害較大的重點真菌毒素，綜述目前國內外其各種人工抗原的制備/合成技術，并分析存在的問題和解決方法，為小分子污染物人工完全抗原的定向 制備以及獲得高親和性高效價抗體提供一定的理論基礎。

真菌毒素；半抗原；人工抗原；制備

真菌毒素（mycotoxin）是由真菌（青霉屬、曲霉屬和鐮孢屬等）產生的具有毒性的次生代謝產物[1-2]，通過直接污染農產品和食品、飼料，間接污染動物產品（乳、肉、蛋）等方式進入食物鏈，威脅人類健康安全。目前對農產品和食品污染和危害 較大、檢出率較高的真菌毒素主要包括黃曲霉毒素（aflatoxin，AF）[4-5]、赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）[6]、伏馬菌素（fumonisins）[7]、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN，又稱F-2毒素）[8]、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON；又稱嘔吐毒素（vomitoxin，VT））[9]、T-2毒素[10]、鏈格孢霉毒素[11]。這些毒 素大多對人體有致畸、致癌、致突變等毒性作用，因此在越來越多國家的受到嚴格控制。截至2003年，至少有100個國家針對各種農產品、食品和飼料制定了真菌毒素的限量法規[12]。因此，建立快速、準確有效的檢測食品中真菌毒素的技術對人類健康意義重大。免疫檢測技術由于具有抗原抗體免疫效應快、特異性強等優點，在真菌毒素高靈敏、快速檢測方面顯現出快速、高效、低成本等巨大優勢，已成為真菌毒素快速檢測的主流技術，在現場實地、通關口岸等各種場合發揮著越來越重要的作用。

目前基于免疫學原理的快速檢測技術主要包括酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[13-14]、膠體金免疫層析等技術（colloidal-gold immunochromatography assay，GICA）生產的免疫親和柱（immnuoaffinity chromatography，IAC）[15]、免疫磁性微球（immunomagnetic microspheres，IMMS）等[16]，這些技術能夠快速準確地檢測糧油中的真菌毒素。在各種免疫速測技術中，抗體的種類和性質決定了免疫分析的靈敏度和特異性。針對真菌毒素、農藥等小分子污染物，能否制備優良性狀的抗體主要由人工完全抗原的制備和抗原免疫過程決定。人工抗原的制備是免疫檢測技術的關鍵前提條件。本文就農產品和食品安全領域重點真菌毒素的人工抗原制備合成、鑒定及研究方法的國內外研究現狀進行了綜述，包括抗原制備中涉及的半抗原設計原則、偶聯位點和連接臂的選擇、載體蛋白的選擇、半抗原的偶聯方法、人工抗原的純化與鑒定等，分析了抗原合成技術與抗體性質間的關系，為制備高效價、高特異性、具有自主產權的克隆抗體及相關檢測試劑盒等各種快速免疫技術產品提供一定理論支持。

1 半抗原的設計與合成

真菌毒素通常分子質量較小（小于1 000 D），僅含單個抗原決定簇，是沒有免疫原性的半抗原。在真菌毒素的免疫檢測應用中，真菌毒素只有進行適當的設計合成、與大分子蛋白進行偶聯制備成完全抗原后，才能完成后續的抗體制備和應用。

1.1 半抗原的設計與合成原則

人工抗原的設計與合成是抗體制備以及建立免疫分析方法的前提，對最終人工抗原的結構及特異性起關鍵作用[17-18]。Goodrow等[19]對半抗原設計要求進行了分析和闡述，認為半抗原設計中必須遵循以下原則：1）在分子結構、立體化學、電子分布和疏水性上應與待測物分子盡可能相似，以便于機體對特征結構進行識別；2）半抗原與載體之間的連接臂具有一定長度的碳鏈，且連接臂應不易誘導機體產生“臂抗體”；3）修飾后的半抗原分子末端需有可直接與載體蛋白質偶聯的活性基團，且活性基團的存在對待測物分子的電子分布應沒有影響；4）半抗原與載體偶聯后仍應保留待測物分子的基本結構。

基于上述原則，真菌毒素等小分子半抗原與蛋白能否發生偶聯的決定因素是真菌毒素小分子半抗原的結構。存在兩類情況：第一類是某些真菌毒素本身分子結構中具有能與載體蛋白上的羧基/氨基反應的氨基/羧基；第二類是真菌毒素沒有可直接與載體共價連接的基團，或雖有活性基團但需要經過一定的改造或轉化才能與載體蛋白偶聯，或直接與大分子載體連接后半抗原的特征結構易受載體的局部微化學環境或空間位阻的干擾，出現影響機體免疫系統識別等情況。

針對第一類情況，真菌毒素本身分子結構中具有能與載體蛋白上的羧基/氨基反應的氨基/羧基結構，一般可以直接與載體蛋白進行偶合，制備人工抗原。如，OTA本身帶有一個游離的羧基（圖1），可以直接與蛋白質氨基偶聯。黃飚[6]采用EDC法偶聯OTA與鑰藍蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH），制備了OTA單克隆抗體。伏馬菌素B1（fumonisin B1，FB1）結構上含有一個游離的氨基（圖2），可以與蛋白質羧基端偶聯。許金俊等[20]采用戊二醛法使FB1上的氨基與與牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）上的羧基偶聯，并成功制備抗FB1單克隆抗體。

圖1 OTA結構式Fig.1 Structure of OTA

圖2 FB 2 FB1結構式Fig.2 Structure of FB1

圖3 AFB1結構式Fig.3 Structure of AFB1

圖4 TeA結構式Fig.4 Structure of TeA

第二類情況中的真菌毒素一般需要重新設計、合成半抗原。如黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）本身性質不活潑，不具有連接蛋白質的活性基團（圖3），需通過適當的衍生化方法，引入活性基團。1977年，Chu等[21]以吡啶為催化劑，在甲醇水中，通過回流將（氨氧基）乙酸半鹽引入AFB1中，使其轉換為AFB1肟化物（AFB1O）。AFB1O通過引入羧基和和載體蛋白質中的氨基等連接，最后成功制備出多克隆抗體。又如，細交鏈孢菌酮酸（tenuazonic acid，TeA）由于分子質量較小且沒有芳香環結構（圖4），即使通過飽和脂肪鏈作為間隔手臂偶聯載體蛋白，仍很難誘導機體產生特異性抗體[22]。楊星星等[23]采用水合肼和乙醛酸對TeA進行衍生化，設計引入含有半剛性氮雜不飽和共軛雙鍵的間隔手臂與載體蛋白偶聯，合成了半抗原TeAH和TeAHGA。

目前半抗原的設計研究主要基于“trial-anderrorassays”，即試錯法，這些設計方法工作量大且帶有很大的經驗性和隨意性[24]。近幾年來，隨著分子模擬技術[25]的開發研究和逐漸應用，研究逐漸開始借助算機對不同的結合位點、連接臂對半抗原進行抗原表位相似度模擬，模擬參數包括空間構型、原子點電荷、疏水常數等，以期尋找最佳偶聯位點與連接臂，同時通過分子軌道能隙計算來預測半抗原的分子穩定性。利用分子模擬技術指導半抗原的設計和篩選，可使半抗原的設計更具目標性、省時省力。

1.2 偶聯位點和連接臂引入點的選擇

圖5 DON結構式Fig.5 Structure of DON

圖6 T-2結構式Fig.6 Structure of T-2

在半抗原設計中，連接位點的選擇決定了抗體的特異性，因此選擇合適的偶聯位點非常重要[26]。孫秀蘭等[27]利用分子模擬技術，采用分子模擬軟件Hyperchem 7.5，對DON（圖5）及半抗原的表位決定參數（空間結構、原子點電荷、疏水常數）進行計算分析，通過對其結果參數以及分子軌道的計算比較，發現3位半抗原具有與DON最相似的結構性質，表明3位是DON引入連接臂的最佳位點，這與Casale[28]的免疫實驗結果一致。T-2毒素（圖6）通常是利用其結構中C-3位置作為引入帶有活性基團的某種有機小分子的位點[29]，從而進一步與載體蛋白偶聯，經常要用到的小分子物質主要有琥珀酸酐、戊二酸酐或者羧甲基肟[30]。

其次，半抗原設計中，為使真菌毒素半抗原突出于載體表面，易為機體免疫系統識別，在半抗原與載體蛋白之間一般會設計一段連接臂，而偶聯較適宜的連接臂的長度為3～6個碳[31]，通常以含末端活性基團（—NH2、—COOH、—OH、—SH等）的鏈烷為宜，并且應盡可能避免間隔臂含較強的決定簇（如芳環、共軛雙鍵或雜原子等），以減少所產生的抗體對間隔臂的過度識別而降低對目標分子的識別能力[32]。除長度外，連接臂的結構對抗原的抗原性也有影響。金萍等[33]在3位羥基設計不同的連接臂結構，并將之進行免疫抗體實驗，測定抗體效價及抑制率。結果表明B組（順丁烯二酸酐臂）抗體平均效價1∶256 000，A組（丁二酸酐臂）、C組（鄰苯二甲酸酐臂）平均效價1∶64 000；DON質量濃度為500 ng/mL時對抗體的抑制率由大到小排列依次為：A組（66.4%）＞B組（21.1%）＞C組（10.8%）。A組與DON具有最高抗原表位相似度，所得抗體特異性強，抑制率高；B組連接臂中含不飽和鍵，增強了半抗原的抗原性，產生的抗體效價高；C組含有苯環，但其羧基端與半抗原主體結構非常靠近，半抗原結構可能被載體蛋白屏蔽而導致其未產生高效價的抗體，綜合考慮丁二酸酐臂是DON最佳連接臂。

2 載體蛋白的選擇

蛋白質由于結構復雜、免疫原性好，可作為大分子載體。它不僅可以增加半抗原的分子質量，而且可以利用其免疫原性誘導免疫應答，對半抗原產生載體效應。目前較常見的載體蛋白有：牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）、卵清白蛋白（ovalburmn，OVA）、人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）、鑰孔血藍蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）、兔血清蛋白（rabbit serum albumin，RSA）；人工合成的載體蛋白有多抗原肽系統（multiple antigenic peptide system，MAP）和多聚賴氨酸（poly-L-lysine，PLL）[34]等。

BSA由于其物化性質穩定、不易變性、廉價易得，且賴氨酸含量高、分子內有很多自由的氨基、在不同的pH值和離子強度條件下均有較大的溶解度、可在含有機溶劑（如吡啶、N,N-二甲基酰胺等[35]）的情況下進行偶聯等優點成為目前最常用的的載體蛋白。KLH雖然與脊椎動物免疫系統具有很好的異源性，但是其價格昂貴。研究表明，MAP能明顯增加線性抗原肽的免疫性，其誘導家兔產生的抗體水平明顯高于單拷貝短肽和偶聯至琥珀酰化鑰孔血藍蛋白載體的肽[36]，未來很有可能用于研制針對多種真菌毒素的人工抗原的制備；而PLL由于經過親水性氨基酸修飾，相當于在整個分子中插入了T細胞表位，免疫原性得到顯著提高[21]。

載體的選擇決定了免疫應答的特異性、融合的效率、特異性克隆的數目以及最終得到的抗體效價[37]，同時偶聯機制和偶聯反應對載體蛋白也有影響。孫秀蘭等[38]通過熒光光譜在分子水平上探討AFB1與BSA載體蛋白的偶聯機制及偶聯反應對BSA的構象影響，推測黃曲霉毒素和牛血清白蛋白反應的結合部位，同時發生在BSA的酪氨酸殘基和色氨酸殘基上，使得BSA疏水性增加，肽鏈伸展程度降低。在ELISA實驗中，為避免載體蛋白干擾檢測，免疫用人工抗原和包被用人工抗原所采用的載體蛋白也應不同[39]。而目前有關載體蛋白純度、分子質量等對最終抗體性狀的影響等方面報道還非常少，其具體影響情況還有待進一步研究。

3 半抗原與載體蛋白的偶聯方法

根據真菌毒素的結構與特性，半抗原偶聯的方法是由其活性基團決定的（表1）。當前真菌毒素人工完全抗原的合成方法，可具體分類為含有羧基或者可羧化、含氨基或者可還原為硝基以及含羥基3種情況。

表1 常見真菌毒素和載體蛋白的偶聯方法[400--4422]]Table 1 Common methods of coupling mycotoxin with carrier proteins[400--4422]]

對于含有羧基或者可羧化的真菌毒素，可通過碳化二亞胺法、混合酸酐法、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）活性酯法與載體蛋白進行偶聯，其中以碳化二亞胺法和混合酸酐法最常用[42]。江湖等[43]采用EDC法先制備了AFB1肟化物，然后用其與C-BSA偶聯兩步反應制備了AFB1人工抗原。馮倩倩等[54]利用環己基碳化二亞胺（N,N’-dicyclohexylcarbodiimide，DCC）的作用使OTA與NHS的羥基縮合成酯（活性酯），在堿性條件下，活性酯不穩定，易受蛋白質中氨基的親核攻擊，最后形成穩定的肽鍵，從而與OVA偶聯。楊振東等[55]則先以氯甲基異丁酯與含有羧基的ZEN反應形成混合酸酐，然后先后與BSA和OVA上的氨基反應得到較高質量的ZEN人工抗原。

含氨基或者可還原為硝基的真菌毒素，可通過戊二醛法[59]、重氮化法等與載體蛋白進行偶聯。鐘秋芳[60]、王瑩[61]等采用戊二醛一步法制備免疫抗原FB1-KLH和包被抗原FB1- BSA，所得FB1-BSA具有高靈敏度。值得注意的是戊二醛易受光照、溫度和堿性的影響，可能發生自我聚合，減弱其交聯能力，操作時應將半抗原溶液緩慢滴加至雙功能交聯試劑中，保證半抗原完全一對一的與雙功能交聯試劑偶聯。鄭其嵐等[58]采用重氮化法，用AME與亞硝酸反應形成重氮鹽與BSA結合支撐人工抗原免疫家兔，獲得了效價較高的抗血清，并初步成功地進行了酶免競爭實驗，證明了抗體的特異性和可應用性。但是該方法反應過程中蛋白質易變性產生大量沉淀，目前較少應用于其他真菌毒素的人工抗原制備。

含羥基的真菌毒素則可通過琥珀酸酐[66]、N,N’-羰基二咪唑（N,N’-carbonyldiimidazole，CDI）法等與載體蛋白進行偶聯。徐娟等[56]在蒸汽浴條件下，用T-2毒素與琥珀酸酐反應合成了T-2HS，并與BSA和OVA結合生成T-2毒素抗原，紫外掃描分析表明其與BSA和OVA偶聯比分別為6.66∶1、10.11∶1，表明此抗原能夠用于免疫動物。Maragos等[64]通過CDI法將DON與載體蛋白OVA、BSA偶聯成功制備了DON人工抗原。

4 人工抗原純化

制備高質量的人工抗原，還需要純化半抗原與載體的偶聯物，去除未反應的半抗原分子、鹽類及其他雜質。抗原純化常用的方法有離心、透析和層析，離心和透析方法使用尤其廣泛。透析一般所需時間較長（2 d以上），純化較為徹底、操作相對簡單。將偶合的反應體系裝入透析袋，放入透析液中并定時更換透析液，直至透析外液檢測不出小分子。層析所需時間較短，但操作相對復雜，需要對流出組分進行跟蹤分析，以確定目標組分[18,40]。近年來超濾技術由于具有通量高、操作條件溫和、易于放大等特點，特別適合生物過程及生物活性大分子的分離純化，廣泛應用于生物產品的固液分離、生物產品的精制、蛋白質以及質粒DNA的分離純化。目前采用超濾技術在食品安全領域中農藥人工完全抗原的純化應用較多，對真菌毒素抗原[61]和抗體[67]純化方面應用處于起步階段，但純化效果較好。王瑩等[61]采用先透析后超濾的方法處理合成的伏馬菌素人工抗原，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）法鑒定得出FB1-BSA和FB1-OVA分別在55 kD和70 kD左右有清晰單一的蛋白條帶，證明人工抗原的純度較好。

5 抗原鑒定方法

人工抗原鑒定是定性判斷半抗原與載體偶聯成功與否的關鍵，同時也可定量測定結合比和蛋白質含量等。最常用的鑒定方法是紫外掃描法[23]。以通過比較游離的半抗原、蛋白質和人工抗原的紫外吸收光譜來判斷是否偶聯成功。SDS-PAGE凝膠電泳法[68]也是比較常用的鑒定方法，主要是利用偶聯后分蛋白質分子質量增大而出現的滯后現象初步判斷偶聯成功與否，操作簡單，使用較為廣泛。核磁共振技術[23,69]可直接判斷該原子在分子中所處的位置及相對數目，是鑒定偶聯成功與否最精確直接的方法，但價格較昂貴，目前應用較少。

定量結合比主要通過紫外分光光度法[70]、紅外光譜法[71]、質譜法[72]等進行測定。前兩者較為常用，主要根據吸收度的加和性原理，分別測定半抗原、載體、偶聯物在吸收峰處吸收度即可計算結合比；質譜法非常適用于精確測定偶聯物中半抗原與載體蛋白的結合比，此法簡便、快速、且結果準確，值得推廣。王瑩等[72]采用基質輔助激光解吸-電離飛行時間質譜法（matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOFMS）對由3種真菌毒素FB1、OTA、DON與兩種載體蛋白OVA、BSA分別偶聯制備得到的4種小分子-載體蛋白偶聯物FB1-OVA、FB1-BSA、OTA-BSA、DON-OVA的偶聯結合比進行測定，并與紫外吸收光譜法進行比較，從結果來看，較紫外吸收光譜法更為簡便準確。

除上述儀器方法外，動物實驗是最有效的鑒定方法，也是抗原制備成功與否的實際驗證方法。但該方法缺點是動物產生針對抗原的抗體需要較長的時間。鄧舜洲[49]將制得的DON人工抗原免疫3只BALB/c小鼠，經4次免疫后（9周），1號小鼠血清抗體效價達125 600，且小鼠血清抗DON多克隆抗體與DON-HG-OVA的結合能被DON標品阻斷，說明DON人工抗原制備成功。

綜上，在實際應用中，可根據具體情況，采用一種或多種方法同時鑒定以確保人工抗原合成成功。曹歡等[73]分別采用薄層色譜法、高效液相色譜和液相-質譜聯用3種技術進行ZEN半抗原的鑒定，采用紫外光譜法、結合比的測定及免疫學方法進行ZEN全抗原的檢測，結果表明目標半抗原和全抗原合成成功。

6 結 語

基于抗原抗體反應的免疫學檢測以其簡便、快速、靈敏度高、特異性強的特點已成為主流的真菌毒素快檢方法。在小分子真菌毒素制備人工完全抗原方面，國內外進行了大量的研究。通過大量國內外文獻資料的查閱，分析了制備真菌毒素人工完全抗原的合成中可能存在的各類問題，并提出了解決問題的途徑和今后研究發展的可能方向。

首先，目前半抗原的設計與合成理論還不夠完善，對于半抗原結構與免疫效果之間的關系還不夠了解且某些真菌毒素結構復雜，在偶聯位點的選擇與連接臂的設計上存在一定盲目性，還需不斷摸索。將3D分子模擬技術應用于真菌毒素人工抗原合成可以快速地確定最佳偶聯位點及連接臂，通過實踐檢驗其準確性也取得了較好成果，對半抗原的結構設計具有指導性意義。

另一方面，針對不同的真菌毒素人工抗原的合成雖有諸多偶聯方法，但是仍存在交叉反應、受多種因素干擾（緩沖液成分、pH值、離子強度、偶聯反應的溫度和時間、半抗原載體物、載體蛋白和偶聯劑在偶聯反應中的相對濃度及其初始的摩爾比等）等缺陷。不同偶聯方法和條件與所合成的人工抗原以及免疫后產生抗體性質的相關性還有待進一步探究并逐步優化。

近年來，分子印跡[74-75]、核酸適配體[76]和噬菌體展示肽庫[77]等技術的出現為真菌毒素的快速檢測提供了新的途徑。它們通過人工合成或直接篩選的方法制備出能與小分子化合物具有特異性識別的聚合物、配體或者多肽，從而用于小分子化合物的分析與測定，這些聚合物、配體或多肽雖然與抗體功能類似，但是在親和力和特異性識別方面還遠遠不及抗體。要制備好的抗體必須要好的抗原，因此，隨著人工抗原制備方法的逐步改進和完善，利用免疫學原理檢測真菌毒素將會成為應用最為廣泛和發展最為成熟的生物檢測方法，為我國糧油食品的安全生產提供有效保障。

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Recent Progress in the Preparation of Artificial Antigen of Mycotoxins

WU Chun-sheng1, MA Liang1,2,3,*, HU Yuan-yuan1, ZHANG Yu-hao1,2,3
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Agro-products on Storage and Preser vations (Chongqing), Ministry of Agriculture, Chongqing 400716, China; 3. Chongqing Special Food Programme and Technology Research Center, Chongqing 400716, China)

The main analytical techniques currently available for rapid detection of mycotoxins include enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and gold-labeled immunochromatography. The synthesis of artificial antigen and the nature of antibodies are the most critical factors in rapid immunological detection of mycotoxins. This paper rev iews the recent progress at home and abroad in the preparation/synthesis of artificial antigens of mycotoxins as hazardous contaminants of cereal and oil products. In addition, some existing problems and corresponding solutions are pointed out. This review will hopefully provide a theoretical basis for preparing artificial antigens of small molecule contaminants and develop the antibodies with high affinity and specificity.

mycotoxin; hapten; artificial antigen; preparation

TS201.6

A

1002-6630（2014）05-0239-07

10.7506/spkx1002-6630-201405047

2013-09-07

國家重點基礎研究發展計劃（973計劃）項目（2013CB127803）；國家自然科學基金項目（31301476）；

中央高校基本科研業務費專項資金項目（XDJK2013B035）

吳春生（1990—），男，碩士研究生，研究方向為食品工程。E-mail：wcs90219@163.com

*通信作者：馬良（1979—），女，副教授，博士，研究方向為食品安全與食品檢測技術。E-mail：zhyhml@163.com