紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生淀粉酶培養(yǎng)基的優(yōu)化

劉 波，曾麗萍，鄔應(yīng)龍,*

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014)

紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生淀粉酶培養(yǎng)基的優(yōu)化

劉 波1，曾麗萍2，鄔應(yīng)龍1,*

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014)

研究碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽對(duì)紅曲霉M2固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生淀粉酶的酶活性影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生淀粉酶的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，并建立乳糖、(NH4)2SO4、K2HPO4變化的二次回歸方程，探討各因素對(duì)生淀粉酶酶活力的影響。在固態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，最終確定適宜的培養(yǎng)基條件為：乳糖添加量為8.18%、(NH4)2SO4添加量為6.36%、K2HPO4添加量為0.91%；在該條件下可得到紅曲霉M2產(chǎn)生淀粉酶的最大酶活力，預(yù)測(cè)值為680.29 U/g，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，得到生淀粉酶酶活力為662.21 U/g。

紅曲霉；固態(tài)發(fā)酵；生淀粉酶；Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

生淀粉酶是指能對(duì)不經(jīng)過(guò)蒸煮糊化的生淀粉顆粒表現(xiàn)出強(qiáng)水解活性的酶類。由于生淀粉酶能將未經(jīng)蒸煮糊化的生淀粉直接轉(zhuǎn)化成葡萄糖等可發(fā)酵性糖供微生物生長(zhǎng)與代謝，其比傳統(tǒng)的高溫蒸煮糖化節(jié)約25%～30%的能耗[1-2]。基于減少能耗和有效利用天然資源的需要，生淀粉的生物能轉(zhuǎn)化過(guò)程引起了廣大科研人員的關(guān)注，并對(duì)能降解生淀粉的酶類進(jìn)行了研究[3-9]。大量研究[10-14]表明，許多真菌和細(xì)菌都能夠產(chǎn)生生淀粉酶，并且通過(guò)發(fā)酵條件等方法的優(yōu)化，其產(chǎn)酶能力可大大增強(qiáng)。如蔡宇杰等[15]用遺傳算法與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)相耦聯(lián)的方法對(duì)生淀粉發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，使生淀粉的活力得到較大的提高。劉軍等[16]則采用了黑曲霉、米曲霉、宇佐美曲霉和少根根霉，并進(jìn)行混株發(fā)酵，從而使分解生淀粉能力得到顯著提高。與此同時(shí)，研究人員對(duì)生淀粉酶的研究主要集中在液態(tài)發(fā)酵[9,12,17]而對(duì)固態(tài)發(fā)酵的研究較少。本研究在對(duì)生淀粉產(chǎn)生菌的最佳碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽的種類和數(shù)量需要進(jìn)行系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面法（response surface methodology，RSM）[18-22]對(duì)其固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組成進(jìn)行篩選和優(yōu)化，旨在提高該菌株的產(chǎn)酶量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅曲霉M2 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)功能性實(shí)驗(yàn)室保藏。

麩皮 雅安市雨城區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)；NaNO3、MgSO4、K2HPO4、葡萄糖、乳糖等均為國(guó)產(chǎn)分析純；PDA培養(yǎng)基（斜面）：土豆300.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、瓊脂20.0 g/L；種子培養(yǎng)基：土豆300.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L；固態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：麩皮10.0 g、蒸餾水12.0 mL。

1.2 儀器與設(shè)備

BT-124S型電子天平 北京賽多利儀器系統(tǒng)有限公司；DHP-420電熱恒溫培養(yǎng)箱 重慶四達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司順達(dá)儀器廠；HHS-9S型恒溫水浴鍋 上海光地儀器設(shè)備有限公司；JOUANBR4i型冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司；UV-2102型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 孢子懸液的制備

取培養(yǎng)好的斜面，用無(wú)菌生理鹽水洗脫孢子后轉(zhuǎn)移至裝有玻璃珠的無(wú)菌三角瓶中，充分搖動(dòng)使孢子散開(kāi)，用帶脫脂棉的無(wú)菌漏斗過(guò)濾除去菌絲得到孢子懸液，將孢子濃度調(diào)整到106個(gè)/mL。

1.3.2 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)

將1 mL孢子懸液接種到固態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在32 ℃條件下，恒溫培養(yǎng)6 d測(cè)定其酶活力。

1.3.3 粗酶液的制備

粗酶液的制備：取培養(yǎng)后的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)物，先稱質(zhì)量，然后加蒸餾水100 mL，在40 ℃水浴中浸提1 h，4層紗布過(guò)濾，3 000 r/min離心15 min。

1.3.4 指標(biāo)測(cè)定

生淀粉酶活力的測(cè)定：參考孫海彥等[12]的方法。先取2.0 mL 2.5 g/100 mL的生玉米淀粉懸浮液，然后加入2.0 mL 0.1 mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH 5.0），40 ℃預(yù)熱10 min，然后再加入1.0 mL粗酶液。40 ℃水浴反應(yīng)30 min后，加入0.5 mL 4 g/100 mL NaOH溶液終止反應(yīng)，反應(yīng)液用3 000 r/min離心10 min，取上清液用DNS法[23]測(cè)葡萄糖量。空白實(shí)驗(yàn)為先加0.5 mL 4 g/100 mL NaOH溶液，再加入酶液，用以消除酶液和生玉米淀粉中游離糖的影響。

生淀粉酶活力單位的定義：在該測(cè)定條件下，1 h釋放1 μmol葡萄糖的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。

1.3.5 培養(yǎng)基成分的篩選

1.3.5.1 碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響

在固態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的玉米粉、可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖和乳糖，于恒溫培養(yǎng)箱中32 ℃培養(yǎng)6 d后測(cè)定酶活力。根據(jù)酶活力的大小確定最佳的碳源種類。

1.3.5.2 氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響

在固態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別添加1%的蛋白胨、牛肉膏、尿素、NaNO3和(NH4)2SO4，于恒溫培養(yǎng)箱中32 ℃培養(yǎng)6 d后測(cè)定酶活力。根據(jù)酶活性的大小確定最佳的氮源種類。

1.3.5.3 無(wú)機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)酶的影響

在固態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別添加0.1%的K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CuSO4·5H2O和CaCl2，于恒溫培養(yǎng)箱中32 ℃培養(yǎng)6 d后測(cè)定酶活力。根據(jù)酶活性的大小確定最佳的無(wú)機(jī)鹽種類。

1.3.6 培養(yǎng)基各成分添加量的單因素試驗(yàn)

1.3.6.1 碳源添加量對(duì)產(chǎn)酶的影響

根據(jù)碳源的篩選結(jié)果，選擇酶活性最高的作為最適碳源。在固態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別添加1%、2%、4%、6%、8%、10%、15%、20%。然后于恒溫培養(yǎng)箱中32 ℃培養(yǎng)6 d后測(cè)定酶活力。根據(jù)酶活力的大小確定最佳的碳源添加量。

1.3.6.2 氮源添加量對(duì)產(chǎn)酶的影響

根據(jù)氮源的篩選結(jié)果，選擇酶活性最高的作為最適氮源。在固態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別添加1%、2%、4%、6%、8%、10%。然后于恒溫培養(yǎng)箱中32 ℃培養(yǎng)6 d后測(cè)定酶活力。根據(jù)酶活力的大小確定最佳的氮源添加量。

1.3.6.3 無(wú)機(jī)鹽添加量對(duì)產(chǎn)酶的影響

根據(jù)無(wú)機(jī)鹽的篩選結(jié)果，選擇酶活性最高的作為最適無(wú)機(jī)鹽。在固態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別添加0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.5%、2.0%。然后于恒溫培養(yǎng)箱中32 ℃培養(yǎng)6 d后測(cè)定酶活力。根據(jù)酶活力的大小確定最佳的無(wú)機(jī)鹽添加量。

1.3.7 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，選用乳糖、(NH4)2SO4、K2HPO4為考察因素，采用Box-Behnken中心組合原理設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)曲面法試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基成分的篩選

2.1.1 碳源的篩選

碳源作為真菌培養(yǎng)基的基本成分之一，能夠?yàn)檎婢纳L(zhǎng)代謝提供能量。同時(shí)它也是菌體細(xì)胞組成的原料，也是菌體生長(zhǎng)發(fā)育必需的能源物質(zhì)。某些碳源是酶的誘導(dǎo)物，選擇適宜的碳源有利于定向促進(jìn)某些酶的合成。不同碳源對(duì)生淀粉酶酶活的影響如圖1所示，紅曲霉可以利用不同的碳源，但碳源類型對(duì)生淀粉酶酶活性的高低影響較小。其中以乳糖為碳源時(shí)，生淀粉酶酶活性要高于其他幾種碳源。因此，選用乳糖作為紅曲霉固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳碳源。

圖1 碳源對(duì)生淀粉酶酶活性的影響Fig.1 Effect of carbon source on the activity of raw-starch-digesting amylase

2.1.2 氮源的篩選

氮的主要功能是提供細(xì)胞原生質(zhì)和其他結(jié)構(gòu)物質(zhì)中的氮素，是微生物細(xì)胞需要量?jī)H次于碳的元素。它是真菌培養(yǎng)基的基本成分之一，用于合成蛋白質(zhì)、核酸等含氮類代謝物。不同氮源對(duì)生淀粉酶酶活性的影響如圖2所示。紅曲霉能很好的利用有機(jī)氮源蛋白胨和無(wú)機(jī)氮源(NH4)2SO4。兩種有機(jī)氮源中，蛋白胨的效果明顯好于牛肉膏。在3種無(wú)機(jī)氮源中，以(NH4)2SO4的效果最好。由于考慮到成本問(wèn)題，故選擇以(NH4)2SO4作為紅曲霉固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳氮源。

圖2 氮源對(duì)生淀粉酶酶活性的影響Fig.2 Effect of nitrogen source on the activity of raw-starch-digesting amylase

2.1.3 無(wú)機(jī)鹽的篩選

除了上述的碳源和氮源外，微生物通常還需要一定量的無(wú)機(jī)鹽來(lái)調(diào)節(jié)其生長(zhǎng)代謝，比如磷是核酸和蛋白質(zhì)的重要組成成分，能夠影響微生物的生長(zhǎng)；而鎂作為許多重要酶的激活劑則能夠影響基質(zhì)氧化和蛋白質(zhì)合成。不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)生淀粉酶酶活性的影響如圖3所示，添加K2HPO4的生淀粉酶酶活性最高，說(shuō)明K2HPO4對(duì)紅曲霉產(chǎn)生淀粉酶優(yōu)于其他幾種無(wú)機(jī)鹽。因此，選擇在固體培養(yǎng)基中添加K2HPO4。

圖3 無(wú)機(jī)鹽對(duì)生淀粉酶酶活性的影響Fig.3 Effect of mineral salt on the activity of raw-starch-digesting amylase

2.2 培養(yǎng)基各成分添加量的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乳糖添加量對(duì)生淀粉酶酶活性的影響

根據(jù)碳源的篩選結(jié)果，紅曲霉固態(tài)發(fā)酵選用乳糖作為最佳碳源。由圖4可知，隨著乳糖添加量的增加，生淀粉酶酶活性逐漸升高；當(dāng)乳糖的添加量達(dá)到8%時(shí)，酶活性達(dá)到最大；而當(dāng)乳糖添加量繼續(xù)增加時(shí)，生淀粉酶酶活性反而下降，這表明過(guò)大的添加量并不利于酶活性的增大。故在本實(shí)驗(yàn)的考察范圍內(nèi)乳糖的最佳添加量為8%。

圖4 乳糖的不同添加量對(duì)生淀粉酶酶活性的影響Fig.4 Effect of lactose level in the medium on the activity of rawstarch-digesting amylase

2.2.2 (NH4)2SO4添加量對(duì)生淀粉酶酶活性的影響

圖5 (NH4)2SO4不同添加量對(duì)生淀粉酶酶活性的影響Fig.5 Effect of ammonium sulphate level in the medium on the activity of raw-starch-digesting amylase

由圖5可知，(NH4)2SO4添加量在1%～6%的范圍內(nèi)，生淀粉酶酶活性隨著添加量的增加而增大，但當(dāng)(NH4)2SO4的添加量超過(guò)6%時(shí)，生淀粉酶酶活性隨著(NH4)2SO4的增加而減小。這表明過(guò)多的添加量并不利于酶活性的升高，只有適宜的添加范圍內(nèi)才有利于紅曲霉產(chǎn)生淀粉酶。故在本實(shí)驗(yàn)的考察范圍內(nèi)(NH4)2SO4的添加量選擇6%。

2.2.3 K2HPO4添加量對(duì)生淀粉酶酶活性的影響

圖6 K 6 K2HPOHPO4的不同添加量對(duì)生淀粉酶酶活性的影響Fig.6 Effect of dipotassium hydrogen phosphate level in the medium on the activity of raw-starch-digesting amylase

由圖6可知，K2HPO4添加量在0.1%～0.8%范圍內(nèi)，生淀粉酶的酶活性隨著添加量的增加而增大，但當(dāng)K2HPO4添加量超過(guò)1.0%時(shí)，生淀粉酶酶活性隨著K2HPO4添加量的增加而減小。這表明過(guò)大的添加量并不利于紅曲霉產(chǎn)生淀粉酶。只有適宜的添加量條件下才有利于紅曲霉產(chǎn)生淀粉酶。故在本實(shí)驗(yàn)考察范圍內(nèi)K2HPO4的最佳添加量為0.8%。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

表1 響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Experimental design and results for response surface analysis

利用Design Expert v7.0.0（Stat-Ease，Inc. minneapolis, MN，USA）軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)表1的試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)表中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生生淀粉酶酶活力（Y）對(duì)乳糖（X1）、(NH4)2SO4（X2）、K2HPO4（X3）的多項(xiàng)回歸方程為：

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表2所示。

表2 生淀粉酶酶活性多項(xiàng)式回歸模型方差分析Table 2 Analysis of variance (ANOVA) for the fitted quadratic polynomial model for raw-starch-digesting amylase

由表2可知，建立的回歸模型顯著（P＜0.05），說(shuō)明方程擬合度較好；失擬項(xiàng)P=0.150 3＞0.05，說(shuō)明失擬項(xiàng)不顯著，殘差由隨機(jī)誤差引起，模型選擇正確；復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.994 5，表明預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值之間具有很高的相關(guān)性；調(diào)整性決定系數(shù)，表明方程模型可信度較高，能夠較好地描述實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化及分析

圖7 乳糖和(NH4)2SOSO4添加量對(duì)生淀粉酶酶活性影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots for the effect of lactose and ammonium sulphate on the activity of raw-starch-digesting amylase

圖8 乳糖和K2HPO4添加量對(duì)生淀粉酶酶活性影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.8 Response surface and contour plots for the effect of lactose and dipotassium hydrogen phosphate on the activity of raw-starch-digesting amylase

圖9 ((NH4)2SO4和KK2HPO4添加量對(duì)生淀粉酶酶活性影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.9 Response surface and contour plots for the effect of ammonium sulphate and dipotassium hydrogen phosphate on the activity of rawstarch-digesting amylase

由圖7～9可知，它們分別反應(yīng)了X1、X2、X3這3個(gè)因素的兩兩交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。通過(guò)Design Expert軟件，進(jìn)行分析計(jì)算，可得到紅曲霉M2固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生淀粉酶的最佳培養(yǎng)基配方為：乳糖添加量為8.14%、(NH4)2SO4添加量為6.41%、K2HPO4添加量為0.91%，在此條件下生淀粉酶酶活力預(yù)測(cè)值可達(dá)680.29 U/g。結(jié)合實(shí)際操作的方便和方差分析結(jié)果，最終確定培養(yǎng)基配方為：乳糖為8.18%、(NH4)2SO4為6.36%、K2HPO4為0.91%。即在22.0 g固態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，乳糖添加量為1.80 g、(NH4)2SO4添加量為1.40 g、K2HPO4添加量為0.2 g。

2.3.3 模型的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證紅曲霉M2固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生淀粉酶的精確性，對(duì)該模型進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。按照此最終培養(yǎng)基參數(shù)進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，可得生淀粉酶酶活力平均值為662.21 U/g，實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值（680.29 U/g）相差較小。表明此模型是可行有效的，并具有一定的實(shí)踐參考價(jià)值。

3 結(jié)論與討論

通過(guò)培養(yǎng)基的篩選，確定了紅曲霉M2固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生淀粉酶的最佳培養(yǎng)基配方：碳源為乳糖，氮源為(NH4)2SO4，無(wú)機(jī)鹽為K2HPO4。在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)紅曲霉產(chǎn)生淀粉酶培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化與評(píng)價(jià)，得到影響生淀粉酶酶活力的二次多項(xiàng)式回歸模型，并對(duì)該模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。最終得到優(yōu)化培養(yǎng)基組成為：乳糖添加量為8.18%、(NH4)2SO4添加量為6.36%、K2HPO4添加量為0.91%；在此條件下可得到生淀粉酶的最高酶活，預(yù)測(cè)值為680.29 U/g，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，可得生淀粉酶酶活力平均值為662.21 U/g，與理論預(yù)測(cè)值基本一致證明該模型合理可靠。研究人員通過(guò)采用不同方法來(lái)提高菌種產(chǎn)生淀粉酶的活力。如羅軍俠[24]以Aspergillus fumigalus MS-09為研究對(duì)象，對(duì)其產(chǎn)耐酸生淀粉糖化酶的培養(yǎng)基條件進(jìn)行了篩選。在優(yōu)化條件下，其酶活力可達(dá)27.59 U/mL。朱文優(yōu)等[2]以米曲霉y18為出發(fā)菌株，通過(guò)2次誘變，獲得了產(chǎn)生淀粉酶活力較高的菌株y18-U-36-D-40，其酶活力達(dá)到434.5 U/mL。孫海彥等[12]通過(guò)搖瓶發(fā)酵，研究了培養(yǎng)基成分對(duì)Penicillium sp.X-1液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生淀粉酶的影響，在最優(yōu)條件下酶活力達(dá)到239 U/mL。劉連成等[25]通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化得出菌株產(chǎn)酶的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基，結(jié)果表明以玉米淀粉為碳源，蛋白胨和酵母膏為復(fù)合氮源時(shí)生淀粉酶活力可達(dá)194.9 U/mL，是優(yōu)化前的1.1倍。蘇小軍等[14]以黑曲霉 AF-1為研究對(duì)象，對(duì)其固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化，得出培養(yǎng)基豆粕粉含量、麩皮添加量和溫度的最佳值分別為11.46%、17.41 g和26.26 ℃，優(yōu)化后的酶活力為204 U/mL。就上述所測(cè)得的酶活力相差較大除了菌種不同的原因外，更多可能是測(cè)定方法及酶活力定義不統(tǒng)一所致。目前紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生淀粉酶的研究未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道。本研究中固態(tài)發(fā)酵具有成本低廉、工藝簡(jiǎn)單、零污染等優(yōu)點(diǎn)，具有較好的工業(yè)化生產(chǎn)潛力。

[1] 朱文優(yōu), 王新惠. 產(chǎn)生淀粉酶真菌的分離篩選及初步鑒定[J]. 釀酒科技, 2009(2): 21-22.

[2] 朱文優(yōu), 周守?cái)? 米曲霉高產(chǎn)生淀粉酶菌株的誘變選育[J]. 中國(guó)釀造, 2010, 29(6): 57-58.

[3] PAN Ming, ZHOU Yongjin, ZHANG Qiang, et al. Screening a rawstarch-digesting glucoamylase strain and study on enzymology properties[J]. Journal of Sichuan University of Science and Engineering: Natural Sicence Edition, 2006, 19(6): 66-68.

[4] MAMO G, GESSESSE A. Production of raw-starch digesting amyloglucosidase by Aspergillus sp. GP-21 in solid state fermentation[J]. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 1999, 22: 622-626.

[5] XU Dongliu, YAN Xu. A novel raw starch digesting α-amylase froma newly isolated Bacillus sp.YX-1: purifi cation and characterization[J]. Bioresource Technology, 2008, 99: 4315-4320.

[6] SUN Haiyan, ZHAO Pingjuan, PENG Ming. Application of maltitol toimprove production of raw starch digesting glucoamylase by Aspergillus niger F-08[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2008, 24: 2613-2618.

[7] GOYAL N, GUPTA J K, SONI S K. A novel raw starch digesting ther-mostable α-amylase from Bacillus sp. I-3 and its use in the direct hydrolysis of raw potato starch[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2005, 37: 723-734.

[8] 曾麗娟, 楊鍵, 陳英, 等. 生淀粉酶生產(chǎn)菌株P(guān)aeni bacillus sp.的篩選和酶的純化及酶學(xué)性質(zhì)[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2007, 26(3): 106-109.

[9] 諸葛斌, 姚惠源, 諸葛健. 生淀粉糖化酶產(chǎn)生菌Rhizopus OR-1UVN培養(yǎng)基優(yōu)化的研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2002, 28(7): 29-30.

[10] OMENU A M, AKPAN I, BANKOLE M O, et al. Hydrolysis of law tuber starches by amylase of Aspergillus nigerAM07 isolated from the soil[J]. African Journal of Biotechnology, 2005, 4(1): 19-25.

[11] EZEJI T C, BAHL H. Production of raw-starch-hydrolysing α-amylase from newly isolated Geobacillus thermodenitrifi cans HRO10[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2007, 23: 1311-1315.

[12] 孫海彥, 張偉國(guó). Penicillium sp. X-1液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)生淀粉酶的優(yōu)化[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2007, 26(3): 106-109.

[13] MARLIDA Y, SAARI N, HASSAN Z, et al. Improvement in rawsago starch degrading enzyme production from Acremonium sp. endophytic fungus using carbon and nitrogensources[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2000, 27: 511-515.

[14] 蘇小軍, 熊興耀, 譚興和, 等. 黑曲霉AF-1固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)生淀粉酶的條件優(yōu)化[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 35(2): 208-212.

[15] 蔡宇杰, 諸葛斌, 張錫紅, 等. 黑曲霉AF-1遺傳算法與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)耦聯(lián)法優(yōu)化生淀粉酶發(fā)酵培養(yǎng)基[J]. 無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào), 2001, 20(4): 421-423.

[16] 劉軍, 朱文優(yōu). 產(chǎn)生淀粉酶系菌株的篩選及其混株發(fā)酵粗酶研究[J].釀酒科技, 2006(12): 51-53.

[17] 李彧娜. 微孢根霉華根霉變種CICIM F0088生淀粉酶系的研究[D].無(wú)錫: 江南大學(xué), 2010.

[18] 曹小紅, 蔡萍, 李凡, 等. 利用響應(yīng)面法優(yōu)化Bacillus natto TK-1產(chǎn)脂肽發(fā)酵培養(yǎng)基[J]. 中國(guó)生物工程雜志, 2007, 27(4): 59-65.

[19] 徐子鈞, 李劍, 梁鳳來(lái), 等. 利用SAS軟件優(yōu)化L-乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基[J].微生物學(xué)通報(bào), 2004, 31(3): 85-87.

[20] 王曉青, 曾洪梅, 石義萍. 農(nóng)用抗生素2-16高產(chǎn)菌株選育及發(fā)酵優(yōu)化組合研究[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2005, 32(6): 7-11.

[21] 高鵬飛, 李妍, 趙文靜, 等. 益生菌Lactobacillus casei Zhang增殖培養(yǎng)基的優(yōu)化[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2008, 35(4): 623-628.

[22] SUN Ying, WANG Zhengfu, WU Jihong, et al. Optimising enzymatic macerationin pretreatment of carrot juice concentrate by response surface methodology[J]. International Journal of Food Science and Technology, 2006, 41(9): 1082-1089.

[23] MILLER G L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 1959, 31: 426-427.

[24] 羅軍俠. 耐酸生淀粉糖化酶的初步研究[D]. 無(wú)錫: 江南大學(xué), 2008.

[25] 劉連成, 陸正清. 生淀粉糖化酶產(chǎn)生菌營(yíng)養(yǎng)條件的初步優(yōu)化[J]. 釀酒科技, 2009(6): 43-46.

Optimization of Medium Components for the Production of Raw-Starch-Digesting Amylase by Monascus M2 in Solid State Fermentation

LIU Bo1, ZENG Li-ping2, WU Ying-long1,*
(College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

The activity of raw-starch-digesting amylase produced by Monascus M2 in solid state fermentation was investigated with respect to three medium components including carbon source, nitrogen source and inorganic salt. Response surface methodology was used to optimize three different levels of lactose, (NH4)2SO4and K2HPO4by setting up a quadratic regression model. The optimized basic solid medium contained 8.18% lactose, 6.36% (NH4)2SO4and 0.91% K2HPO4. The resulting maximum predicted activity of raw-starch-digesting amylase was 680.29 U/g, compared to 662.21 U/g observed in validation experiments.

Monascus; solid-state fermentation; raw-starch-digesting amylase; Box-Behnken experiment design

TS231

A

1002-6630（2014）07-0181-06

10.7506/spkx1002-6630-201407036

2013-07-10

劉波（1987—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)楣δ苄允称贰-mail：scmslb0425@163.com

*通信作者：鄔應(yīng)龍（1963—），男，教授，博士，研究方向?yàn)楣δ苄允称贰-mail：wuyinglong99@163.com