不同來源膠原蛋白抗凍活性的研究

阮功成，曹 慧，徐 斐，于勁松

不同來源膠原蛋白抗凍活性的研究

阮功成，曹 慧*，徐 斐，于勁松

（上海理工大學醫療器械與食品學院，上海 2000 93）

采用酶法制備不同來源的膠原蛋白，并對其純度及氨基酸組成進行鑒定。在此基礎上，利用差示掃描量熱儀及低溫顯微鏡對其熱滯活性（thermal hysteresis activity，THA）和重結晶抑制效應（ice recrystallization inhibition，IRI）進行了研究。結果表明：所制備的膠原蛋白均為典型的Ⅰ型膠原，純度較高，其分子質量約為330 kD；相比于牛血清白蛋白，不同來源的膠原蛋白中，豬皮膠原具有較高的熱滯活性，即當保留溫度為-0.2 ℃，體系冰晶含量φ≤5% 時，THA為0.52 ℃；在豬皮膠原蛋白體系中形成的冰晶為不規則的圓球形，不易對細胞及組織造成傷害，且經過一次循環后，冰晶無顯著增大。

抗凍活性；膠原蛋白；熱滯活性；重結晶抑制效應

抗凍蛋白是生物為適應極端寒冷環境而產生的一類多肽或糖肽[1-2]，能以非依數形式降低溶液的冰點，但對熔點影響甚微。抗凍蛋白最早在極地魚類中被發現[3]。至今為止，人類已經在海洋魚類、陸地昆蟲、植物、細菌和真菌等生物體中分離得到多種抗凍蛋白[4-6]。雖然不同種類的抗凍蛋白結構各不相同，但它們都具有阻止冰晶形成、調控胞外冰晶的增長、抑制冰的重晶化，、維持液體的非依凍狀態等特點。抗凍蛋白特殊的抗凍機制，使其在食品加工與保藏、冰凍手術、器官保藏及移植領域受到廣泛關注。但抗凍蛋白的生產仍存在成本較高、不易產業化的特點，因而找到合適的抗凍蛋白新資源成為亟待解決的問題。

畜禽下腳料中富含膠原蛋白，膠原序列中除了-Gly-Pro（Hyp）-Y-三肽重復單元外，還有許多-Gly-Z-Y-序列[7-8]。這些重復單元與Graham等[9]從雪蚤中提取的兩種抗凍蛋白（antifreeze protein，AFP）的重復序列-Gly-X-X-非常相似[10]。因而，本實驗采用酶法制備了不同來源的膠原蛋白，并利用差示掃描量熱法及低溫顯微鏡法對其熱滯活性（thermal hysteresis activity，THA）和重結晶抑制效應（ice recrystallization inhibition，IRI）進行了測定，以期為抗凍蛋白新資源的研究與開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

實驗用雞皮、魚皮、豬皮購自于當地菜市場，-20 ℃保存。

胃蛋白酶（1∶10 000） 美國Sigma公司；Ⅰ型膠原標準品、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、溴酚藍及過硫酸銨（均為電泳純） 上海博蘊生物科技有限公司；其余試劑均為分析純 國藥集團化學試劑有限公司。

4K15型冷凍離心機 美國Sigma公司；LGJ-10型冷凍干燥機 北京四環科學儀器廠；垂直板電泳儀 美國Bio-Rad公司；PYRIS-1型差示掃描量熱儀（differential scanning calorimeter，DSC） 英國Perkin Elmer公司；Olympus BH-2相差顯微鏡 上海普赫光電科技有限公司。

1.2 膠原蛋白的提取

根據文獻[11-16]的方法從不同原料中提取膠原蛋白，具體如下：將原料剪碎（0.2 cm×0.2 cm），以10 倍體積10%丁醇溶液脫脂24 h，每12 h換一次丁醇溶液，再用蒸餾水洗凈；用0.5 mol/L醋酸溶液浸泡脫脂后的豬皮12 h，并以10倍體積的0.5 mol/L醋酸溶液勻漿，在勻漿液中在加入1 g/100 mL胃蛋白酶水解48 h，離心（5 000×g，40 min），收集上清液；在上清液中加入NaCl粉末進行鹽析 （使NaCl的終濃度為0.9 mol/L），靜置24 h后離心（5 000×g，60 min）；收集沉淀溶于0.5 mol/L醋酸，并依次用0.02 mol/L的NaH2PO4（pH 8.6）、0.1 mol/L醋酸、蒸餾水作為透析外液進行透析，每2 h換一次透析外液；將透析袋內的樣品溶液凍干，-20 ℃保存備用。

1.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

采用SDS-PAGE電泳鑒定膠原蛋白的純度[17]。其中分離膠8 g/100 mL，濃縮膠5 g/100 mL。將制備的膠原蛋白溶液置于沸水浴中煮沸 3 min，10 000 r/min 離心10 min，取上清液15 μL上樣。120 V電壓電泳完畢后，用0.1 g/100 mL考馬斯亮藍R-250溶液染色6 h，醋酸溶液脫色至背景無色后用凝膠分析儀拍照。

1.4 氨基酸分析

將制備好的膠原蛋白溶解在6 mol/L鹽酸中，110 ℃水解24 h，蒸干鹽酸，定容得水解液。采用Agilent1100高效液相分析儀分析水解液中氨基酸組成[18]。

1.5 膠原蛋白的熱滯活性

將膠原蛋白樣品配制成20 mg/mL的水溶液。稱取一定質量的膠原蛋白密封于鋁皿內，并置于DSC儀器內。當儀器充滿液氮并穩定后，首先降溫至-20 ℃保持5 min，再升溫至10 ℃保持5 min，獲得膠原蛋白溶液的熔融熱（ΔHm）和熔點（Tm）。接著，將樣品降溫至-20 ℃保持5 min，然后緩慢升溫至樣品呈部分熔化狀態，即到達其保留溫度（Th），保持15 min，再將溫度從Th降至-20 ℃。重復上述過程[19-20]，在不同的Th條件下停留15 min，分別記錄不同Th時樣品的起始結晶溫度（T0）以及結晶熱（ΔHr），并分別按照公式（1）和（2）計算THA和冰晶含量（φ）。以無抗凍活性的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）作為對照。

1.6 膠原蛋白的重結晶抑制效應

采用Olympus BH-2相差顯微鏡和攝像裝置觀察膠原蛋白溶液中冰晶的生長習性和冰晶形態[21-22]。將不同來源的膠原蛋白樣品稀釋成質量濃度為20 mg/mL的溶液，取10 μL滴到鋁板上，形成半徑約為5 nm，厚度約為50 μm的小冰盤。然后將其轉移到復合顯微鏡的冷臺上，以20 ℃/min的速率降溫至-40 ℃，保持5 min，再以1 ℃/min的速率升溫至-14 ℃，拍照，并在-14～-12 ℃之間循環，且循環周期為3 min，并拍照。

2 結果與分析

2.1 SDS-PAGE電泳

圖1 不同來源膠原蛋白的SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE of collagens from different sources

由圖1可知，在SDS-PAGE圖譜上出現了α1、α2、β及γ 4 個條帶。其中，在分子質量約110 kD附近出現的2 個條帶分別為膠原蛋白的α1和α2鏈；在220 kD附近出現的條帶是α鏈的二聚體，即β鏈；在高于220 kD出現的條帶是α鏈的三聚體，即γ鏈。根據已有的資料表明[23]，這是典型的Ⅰ型膠原蛋白SDS-PAGE圖譜。圖譜上無其他雜帶，可見所 提膠原蛋白具有較高的純度。

2.2 氨基酸分析

表1 不同來源膠原蛋白的氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of collagens from different sources個/1 000個殘基

由表1可知，不同來源膠原蛋白的氨基酸組成比較相近[11,24]。在常見氨基酸中，甘氨酸、脯氨酸和丙氨酸含量較高，其中甘氨酸含量幾乎占了總氨基酸的1/3，脯氨酸和丙氨酸含量分別約為10%左右；組氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸含量較低；沒有檢測出半胱氨酸，缺乏色氨酸。在非常見氨基酸中，羥脯氨酸含量也較高，但在不同來源的膠原蛋白中其含量差異較大。

據研究，膠原中最主要的重復單元是（-Gly-X-Y）n和（-Gly-Z-X-）n，其中X可能是脯氨酸或羥脯氨酸，Y代表20 種氨基酸中的任何一種[24-25]。這種三肽重復序列中一些分子質量較小的氨基酸殘基（如Pro、Hyp、Ser、Thr等）的羰基氧原子處于同一個肽平面，且氧原子之間的距離與排列方式與冰晶氧原子相似，因而形成的肽平面可通過氫鍵結合于冰晶的表面，從而抑制其生長[26]。脯氨酸和丙氨酸殘基的烷基側鏈可提供部分的非極性環境以穩定氫鍵的相互作用。Corcilius等[27]研究發現，羥脯氨酸聚合物及肽鏈長度對冰晶的重結晶抑制效應（ice recrystallization inhibition，IRI）有顯著影響。

2.3 DSC對不同來源膠原蛋白熱滯活性的測定

2.3.1 膠原蛋白樣品的升降溫曲線

以無抗凍活性的BSA為對照，測定了豬皮膠原蛋白的熔融點及結晶點，結果如圖2所示。BSA在-1.12 ℃開始熔化，在0.94 ℃完全熔化，而膠原蛋白在-1.43 ℃開始熔化，0.46 ℃完全熔化，二者熔融峰無顯著差異，都比較平緩。BSA的起始結晶溫度為-14.18 ℃，降至-14.36 ℃時完全結晶，其結晶峰很窄僅為0.18 ℃，而膠原蛋白溶液在-15.42 ℃開始結晶，降溫至-17.75 ℃時凍結完全，其結晶峰相對較寬為2.33 ℃。相比于BSA，膠原蛋白在降低溶液起始結晶溫度的同時，也延長了其完全凍結所需要的時間。這可能是由于膠原蛋白通過氫鍵將其極性側鏈吸附于冰晶表面，而其非極性側鏈暴露在外，使冰晶形成了亞顯微曲線表面，導致冰晶表面自由能增加，從而阻止其他水分子進一步與冰晶結合，降低了冰點。

圖2 膠原蛋白（a）與BSA（b）的升降溫曲線Fig.2 DSC curves of collagen (a) and BSA (b) during freezing and melting processes

2.3.2 BSA的熱滯活性

將完全凍結的BSA升溫至不同保留溫度，使之處于部分熔化狀態，在不同的保留溫度停留一段時間，再次降溫使之完全結晶。不同保留溫度下BSA的熱流曲線如圖3所示，不同保留溫度下BSA的THA如表2所示。

圖3 BSA的DSC熱流曲線圖Fig.3 DSC curve of BSA

表2 不同保留溫度下BSA的熱滯活性Table 2 THA of BSA at various retention temperatures

由表2可知，隨著保留溫度Th的升高，部分熔融BSA平衡體系中融化量逐漸增大，冰晶含量隨之逐漸減少。進一步降溫，已融化部分立即重新結冰，放熱峰同時出現，且隨著保留溫度Th的升高，再次凍結峰的面積逐步增大（圖3）。變溫前后的曲線平滑銜接，不存在凍結滯后的現象，也就是說BSA溶液不存在熱滯效應。

2.3.3 不同來源膠原蛋白的熱滯活性

將完全凍結的不同來源的膠原蛋白升溫至不同保留溫度，使之處于部分熔化狀態，在不同的保留溫度停留一段時間，再次降溫使之完全結晶。不同保留溫度下各膠原蛋白的熱流曲線如圖4～6所示，不同保留溫度下各膠原蛋白的THA如表3～5所示。

圖4 雞皮膠原蛋白的的DSC熱滯曲線Fig.4 DSC curve of chicken skin collagen solutio n

表3 雞皮膠原蛋白溶液的熱滯活性參數Table 3 THA parameters of chicken skin collagen

由圖4、表3可見，雞皮膠原的熱滯活性較低，當保留溫度為0.09 ℃時，其熱滯活性最高僅為0.2 ℃。

圖5 魚皮膠原蛋白的DSC熱滯曲線Fig.5 DSC curve of fish skin collagen solution

表4 魚皮膠原蛋白溶液的熱滯活性參數Table 4 THA parameters of fish skin collagen

由圖5、表4可知，在魚皮膠原體系中，隨著保留溫度的升高，即冰晶含量的逐漸降低，其熱滯活性增加，當冰晶含量小于5%時，凍結滯后明顯，其THA為0.41 ℃。

圖6 豬皮膠原蛋白溶液的DSC熱滯曲線Fig.6 DSC curve of pig skin collagen solution

表5 豬皮膠原蛋白溶液的熱滯活性參數Table 5 THA parameters of pig skin collagen

由圖6、表5可知，在豬皮膠原體系中，隨著保留溫度的升高，即冰晶含量的逐漸降低，熱滯活性同樣呈增加的趨勢。當保留溫度為-0.2 ℃，冰晶含量為5%時，最大的THA被獲得，即為0.52 ℃。

隨著冰晶含量的減少膠原蛋白的THA呈增大趨勢，這可能是由于處于部分熔融狀態的膠原蛋白溶液在結晶過程中，是以體系中已含有的冰晶為冰核開始結晶，體系中冰晶含量越少，冰晶表面膠原蛋白的吸附覆蓋程度越高，膠原蛋白抑制冰晶繼續生長的作用就越強，其溶液完全結晶所需的時間就越長，進而測得的THA也就越高。但是當初始冰晶量降到很低甚至接近于零時，體系中就不存在冰晶核，膠原蛋白不能吸附到冰晶表面而發揮作用，表現出過冷現象。由此可見，膠原蛋白的THA并不是某個恒定的值，而是在一定范圍內與初始冰晶量呈負相關。膠原蛋白形成的右手螺旋可通過低分子質量氨基酸形成的肽平面向冰核棱面上堆積，并抑制其生長，因而不同來源膠原蛋白熱滯活性的差異可能是其空間結構及氨基酸組成的差異導致。

2.4 低溫顯微鏡法測定不同來源膠原蛋白的重結晶抑制效應

重結晶是指已經形成的冰晶顆粒之間重新進行分配，冰晶尺寸有的增大，有的減小，或者小冰晶聚合成大的冰晶。抗凍蛋白可以吸附到冰晶表面，抑制冰晶的遷移，從而產生重結晶抑制效應, 保護有機體免受凍結引起的傷害[2]。重結晶抑制效應可以通過低溫顯微鏡觀察法進行檢測。

圖7 低溫顯微鏡觀察法測定不同來源膠原蛋白的重結晶抑制效應Fig.7 Cryomicroscopic observation of ice recrystallization inhibition in collagen from different sources

BSA體系中形成的冰晶形態多為扁長形（圖7Ⅰa），經過一次循環后，冰晶顯著增大（圖7Ⅰb）。而在各類膠原蛋白形成的體系中，冰晶多為不規則的圓球形（圖7Ⅱa、7Ⅲa及7Ⅳa）。研究表明，生物避免冰凍傷害必須滿足兩個條件：1）冰必須在胞外形成；2）冰晶的大小及形狀要受到控制。因此相比于BSA體系中形成的扁長形冰晶，膠原蛋白對冰晶的修飾作用在細胞及組織的保護中尤為重要[22-23]。經過一次循環后，豬皮膠原蛋白體系中的冰晶并沒有顯著生長（圖7Ⅱb），表明其對重結晶有一定的抑制效應。

3 結 論

采用酶法制備了不同來源的膠原蛋白，并對其純度、氨基酸組成及抗凍活性進行了研究。結果表明，從魚皮、雞皮及豬皮中提取的膠原為典型的Ⅰ型膠原，且具有較高的純度；不同來源膠原蛋白的THA存在差異，當膠原蛋白質量濃度為20 mg/mL 時，豬皮膠原的THA為0.52 ℃，魚皮膠原為0.41 ℃，雞皮膠原為0.2 ℃，這可能是由于膠原空間結構及氨基酸組成的不同導致；膠原蛋白的THA并不是某個恒定的值，而是在一定范圍內與初始冰晶量呈負相關；相比于BSA體系中形成的扁長形冰晶，各類膠原蛋白體系中的冰晶形態多為不規則的圓球形，經過一次循環后，豬皮膠原蛋白體系中的冰晶并沒有顯著生長，可見其對重結晶有一定的抑制效應。

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Antifreeze Activity of Collagens from Different Sources

NGUYEN Cong Thanh, CAO Hui*, XU Fei, YU Jin-song
(School of Medical Instruments and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China)

In this study, collagens from different sources were prepared by means of enzymatic hydrolysis, and their purity and amino acid composition were identified. Differential scanning calorimetry (DSC) was used to determine the thermal hysteresis activity (THA), and the ice recrystallization inhibition (IRI) was evaluated by cryomicroscopy. The results showed that all the collagens prepared were typical type I collagen with high purity and molecular weight of about 330 kD. The collagens from different sources had common amino acid composition with glycine, proline and alanine as the most abundant amino acids. Compared with bovine serum albumin (BSA), the T0of pig skin collagen revealed a higher THA value (0.52 ℃), and the ice crystal content φ was equal to or less than 5% at a retention temperature Thof -0.2 ℃. As observed under a microscope, pig skin collagen extracts formed a large number of hexagonal ice crystal, demonstrating the antifreeze activity when compared with chicken skin collagen and fish skin collagen.

antifreeze activity; collagen; thermal hysteresis activity; ice recrystallization inhibition

Q51

A

1002-6630（2014）17-0022-05

10.7506/spkx1002-6630-201417005

2013-09-26

國家自然科學基金青年科學基金項目（31201421）；國家高技術研究發展計劃（863計劃）項目（2013AA102207）

阮功成（1981—），男，博士研究生，研究方向為食品安全檢測。E-mail：congthanhcnsh@gmail.com

*通信作者：曹慧（1976—），女，副教授，博士，研究方向為功能性配料及添加劑。E-mail：caohuian@126.com