豆豉后發酵中優勢菌株篩選及其生產性能

胡會萍，劉丹赤，殷麗君，程永強，丁立孝

豆豉后發酵中優勢菌株篩選及其生產性能

胡會萍1，劉丹赤1，殷麗君2，程永強2，丁立孝1

（1.日照職業技術學院海洋工程學院，山東 日照 276826；2.植物源功能食品北京市重點實驗室，中國農業大學食品科學與營養工程學院， 北京 100083）

為了更好地控制傳統豆豉后發酵過程，實現多菌純種發酵，確保豆豉的質量安全。本實驗對豆豉后發酵過程中的優勢有益微生物進行研究。以北京仙源豆豉及部分市售豆豉為實驗材料，對其中的酵母菌、芽孢桿菌和乳酸菌進行分離鑒定，并對分離菌株的抑菌性能、產酶性能以及耐鹽和耐溫等生產性能進行研究。最后選出適合于豆豉后發酵的6 株優勢有益菌株，經分子生物學鑒定，確定為枯草芽孢桿菌（B.subtilis），解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens），戊糖片球菌（P. pentosaceus），食竇魏斯氏菌（W. cibaria），東方伊薩酵母（I. orientalis）和熱帶假絲酵母（C. tropicalis）。

豆豉；后發酵；優勢菌株；生產性能

傳統發酵食品中微生物的多樣性研究及性能優良菌株的篩選一直都是國內外發酵食品的研究熱點，其不僅決定產品的質量及安全性，而且也是保證傳統發酵食品實現工業化生產的基本要素之一，選育優良的發酵菌株尤其起著最為關鍵的決定性作用[1]。豆豉是以大豆為主要原料，經過浸泡蒸煮，利用微生物發酵制成的一種具有獨特風味的傳統發酵豆制品，是我國勞動人民最早利用微生物釀造的食品之一[2]。目前，我國傳統豆豉的生產大多還是采用自然發酵，在多種有益微生物共同生長的同時，也會有一些有害微生物的參與，這不僅影響著豆豉產品質量的穩定性，也存在著很大的安全隱患，同時也是豆豉生產中面臨的最大的挑戰。因此，研究豆豉發酵中的微生物菌相組成，明確其中優勢有益菌的種類，控制有害菌，掌握優勢菌的生產性能，將會對傳統豆豉的工業化生產起到非常重要的實際意義。本實驗研究了豆豉后發酵中微生物的分布，進行了優勢有益菌株的分離篩選，并考察了有益菌株的抑菌能力、產酶能力、耐溫能力及耐鹽能力等生產性能，對篩選到的優勢有益菌進行了分子生物學鑒定，為實現傳統豆豉后發酵的質量控制，奠定一定的微生物學研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

豆豉后發酵樣品采集于北京仙源釀造食品有限公司。用滅菌后的包裝紙袋從曲房和發酵車間分別采集成曲（后發酵0周）、后發酵第1周、第2周、第3周和第4周的樣品各500 g。其他市售商品豆豉樣品均購自超市，所有 采集到的樣品均置于4 ℃冰箱保藏備用。仙源豆豉的生產工藝流程如下：

1.2 培養基、菌種與試劑

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potato dextrose agar，PDA）、MRS瓊脂培養基、營養瓊脂培養基、革蘭氏染色液、NB、PDB、MRS液體培養基 北京奧博星生物技術有限責任公司。

大腸桿菌（Escherichia coli）O78、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）26003 中國科學院微生物研究所；蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus） 本實驗室保藏。

可溶性淀粉、三丁酸甘油酯、丙酸鈉、乙酸、過氧化氫、丙三醇（甘油）、DBB等其他試劑均為分析純。

1.3 儀器與設備

HPS-250生化培養箱 哈爾濱市東明醫療儀器廠；YXQ-LS-50立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；COIC光學顯微鏡 重慶光電儀器有限公司；GL-20B高速冷凍離心 機 上海安亭科學儀器廠；UV mini 1240紫外-分光光度計 日本Shimadzu公司。

1.4 方法

1.4.1 豆豉后發酵中微生物菌株分離鑒定

采用稀釋涂布分離法進行菌株的分離。稱取10 g豆豉樣品，無菌操作移入90 mL滅菌生理鹽水中，然后依次進行10 倍梯度稀釋，選擇適宜的稀釋度，各取0.1 mL涂布于平板上，每個稀釋度做3 個平行，經培養后，挑取形態不同的單菌落，經多次劃線純化，得到純菌株，對純化后的分離菌株進行菌落形態和菌體形態的觀察描述，選擇有代表性的菌株進行生理生化鑒定實驗。其中分離酵母菌采用PDA平板，28 ℃培養3～5 d，根據《真菌鑒定手冊》和《酵母菌的特征和鑒定手冊》進行鑒定。分離芽孢桿菌時，樣品事先于80 ℃水浴1 5 min，取0.1 mL涂布于營養瓊脂平板，37 ℃培養24 h，根據《伯杰氏細菌鑒定手冊》和《常見細菌鑒定手冊》進行鑒定。分離乳酸菌采用含有1% CaCO3的MRS平板，37 ℃培養24 h，根據《伯杰氏細菌鑒定手冊》和《乳酸菌分類鑒定和實驗方法》進行鑒定。

1.4.2 豆豉后發酵中分離菌株生產性能測定

將分離菌株分別在適宜的液體培養基中連續轉接活化培養2 次。芽孢桿菌用NB液體培養基，37 ℃培養24 h；乳酸菌用MRS液體培養基，37 ℃培養24 h；酵母菌用PDB液體培養基，28 ℃培養48 h。所得到的培養液用于菌株的抑菌性能、產酶性能、溫度耐受能力、食鹽耐受能力等生產性能的檢測，并結合測定結果對所分離到的芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌進行優良菌株的篩選。

1.4.2.1 菌株抑菌能力的檢測

參照Papamaloni等[3]方法，采用瓊脂擴散法。以大腸桿菌（Escherichia coli）O78、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）26003、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）作為抑菌實驗的指示菌，將各個菌株活化兩次后，用無菌生理鹽水稀釋至菌懸液濃度為107個/mL。吸取0.1 mL稀釋后的指示菌菌懸液涂布于營養瓊脂培養基上，靜置5 min后，用直徑為6 mm的無菌打孔器打孔，取50 μL分離菌株離心后的發酵液，于4 ℃、15 800×g冷凍離心10 min，加入孔中，培養24～48 h，觀察是否出現抑菌圈，準確記錄出現的抑菌圈直徑（包括孔的直徑），每株菌做2 個平行實驗。

1.4.2.2 菌株產酶能力的檢測

參照Amoa-Awua等[4]方法，采用瓊脂擴散法。分別傾倒用于鑒別不同胞外酶的固體培養基制作平板，產蛋白酶用10 g/100 mL脫脂乳粉培養基，淀粉酶用淀粉瓊脂培養基，脂肪酶用三丁酸甘油酯 瓊脂。待培養基凝固后用6 mm無菌打孔器進行打孔，在孔中分別接種50 μL離心后的發酵液，培養24～48 h，觀察是否出現透明圈，淀粉瓊脂平板先用碘液染色后再觀察，準確記錄出現的透明圈直徑，每株菌做2 個平行實驗。

1.4.2.3 菌株耐鹽和耐溫能力的檢測

采用光電比濁法。培養基的鹽質量濃度設定為0、5、10、15 g/100 mL，不同培養溫度設定為30、35、40、45 ℃，以未接菌的培養基做空白對照，分別在600 nm波長處測定加入未培養菌液的OD值與培養24～48 h后的菌液的OD值，每個實驗平行3 次。用培養前后OD值差（培養后OD值減去培養前OD值）來表示菌株在不同鹽質量濃度和不同培養溫度中的生長情況。

1.4.3 優勢菌株分子生物學鑒定

將活化好的純菌培養液送北京理化檢測中心測序，細菌檢測16S rDNA，酵母菌檢測26S rDNA。測序的結果用Chromas2.23軟件進行處理后，登錄NCBI（www.ncbi. nim.nih.gov/blast/）數據庫，將所得到的序列與數據庫中的已知序列進行比對、鑒定菌種。

1.5 數據處理

采用Excel2003軟件進行統計分析和處理。

2 結果與分析

2.1 豆豉樣品中酵母菌菌株分離

本實驗共分離到15 株酵母菌，根據鑒定手冊，結合形態學分析和部分生理生化實驗（包括糖發酵實驗、氮源同化、硝酸鹽還原實驗及部分碳水化合物同化實驗），對酵母菌進行初步鑒定歸屬，鑒定結果見表1，在豆豉樣品中存在著多種酵母菌，經初步鑒定分為5 個屬，分別是紅酵母屬（Rhodotorula）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）、酵母屬（Saccharomyces）、漢遜酵母屬（Hansenula）和假絲酵母屬（Candida）。其中分離到的酵母屬的菌株最多，占總分離酵母菌株數的40.0%，其次是伊薩酵母屬，占總分離酵母菌株數的26.7%。分離到菌株數最少的是紅酵母屬和漢遜酵母屬，各占分離總酵母菌株數的6.7%。其中酵母屬、漢遜酵母屬和假絲酵母屬是多數植物發酵食品中的主要酵母菌[5]。在大豆天培中也檢測到假絲酵母屬、畢赤酵母屬、漢遜酵母屬、紅酵母屬等大量的酵母菌[6]。Hounhouigan等[7]報道了用一種假絲酵母和兩種乳酸菌作為混合發酵劑生產發酵谷物產品mawe。假絲酵母也作為一種功能性發酵劑被用于酸面團的發酵中[8]。伊薩酵母屬常見于釀造酒如葡萄酒、香檳酒等，可以發酵降解木質纖維素產生乙醇，常見的菌種是東方伊薩酵母，其可用作耐高溫生香酵母[9-10]。在哈薩克族傳統發酵乳中也檢測到了東方伊薩酵母[11]。

2.2 豆豉樣品中芽孢桿菌的分離

表1 豆豉樣品中分離酵母菌的形態及生理生化特征Table 1 Morphological, physiological and biochemical traits of yeasts isolated from Douchi samples

表2 豆豉樣品中分離芽孢桿菌的形態及生理生化特征Table 2 Morphological, physiological and biochemical traits of Bacillus isolated from Douchi samples

芽孢桿菌種屬具有較強的產蛋白酶和淀粉酶的能力，普遍存在于發酵大豆食品中，是其中的優勢菌群。本實驗共分離到102 株芽孢桿菌。根據菌體形態、菌落形態及生理生化實驗進行鑒定，鑒定結果見表2。共鑒定為6 個種，分別是 解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、堅 強芽孢桿菌（Bacillus fir mus）、枯草芽孢桿菌（Bacil lus subtilis）、短小芽孢 桿菌（Bacillus pumilu s）、凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）和蠟樣芽 孢桿菌（Bacillus cereus）。其中枯草芽孢桿菌（B. subtilis）所占比例 最大，占到總數的28.4%，其次是解淀粉芽孢桿菌（B. amylo liquefaciens）和堅強芽孢桿菌（B. firmus），分別占到總數的18.6%和16.7%。但是有10 株鑒定為有致病性的蠟樣芽孢桿菌（B. cereus），占到總數的9.8%，其不能作為有益菌的選擇菌株。在貴州陳窯豆豉粑中的研究，也發現細菌以泛酸芽孢桿菌（B.pantothenticus）、蜂房芽孢桿菌（B.alvei）和堅強芽孢桿菌（B. firmus）等芽孢桿菌為優勢菌群[12]。Nora等[13]從自然發酵的大豆食品dawadawa中分離得到的4 株優勢菌株，鑒定為枯草芽孢桿菌（B. subtilis）并對其進行了生產性能方面的研究，成功將純菌株應用于dawadawa的發酵中。

表3 豆豉樣品中分離乳酸菌的形態及生理生化特征Table 3 Morphological, physiological and biochemical traits of lactic acid bacteria (LAB) isolated from Douchi samples

2.3 豆豉樣品中乳酸菌的分離

本實驗共分離到69 株分解碳酸鈣形成透明圈，革蘭氏陽性，接觸酶陰性，乳酸紙層析陽性的乳酸菌菌株。根據菌體形態、菌落形態及生理生化實驗進行鑒定歸屬，鑒定結果見表3。共 鑒定為4 個屬，分別是乳桿菌 屬（Lactobacill us）、片球菌屬（Ped iococcus）、魏斯氏菌屬（Weissella）和腸球菌屬（Enterococcus）。其中片球菌（Pediococcus）所占比例最大，占到總數的34.8%，其次是魏斯氏菌屬（Weissella），占總數的29%，分離到的腸球菌屬（Enterococcus）最少，占到總數的13.0%。Chen等[14]對臺灣當地的一種類似于豆豉的發酵黑豆產品中分離到大量的乳酸菌，主要有屎腸球菌（Enterococcus faecium）及魏斯氏菌屬（Weissella）。乳桿菌屬（Lactobacillus）、片球菌屬（Pediococcus）是發酵豆制品中的常見乳酸菌，如植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、乳酸乳桿菌（Lactobacillus lactis）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）等，在發酵過程中起著生物防腐的作用，同時對發酵產品良好的風味的形成也起著非常重要的作用，而且有些菌株已被用作功能性發酵劑應用于傳統發酵食品中[15]。

2.4 分離菌株的抑菌能力

選擇具有抑菌能力的微生物，開發功能性發酵劑，保證發酵食品的安全生產，一直以來都是國內外傳統發酵食品的研究熱點[16]。大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌是傳統發酵豆制品中經常檢測到的致病微生物，對產品造成了一定的安全隱患。因此，考察分離菌株對致病微生物的抑菌作用是十分 有意義的。本實驗中對分離菌株的抑菌能力測定結果見表4，有17 株芽孢桿菌有抑菌作用，其中菌株B3、菌株B4和菌株B9對3 種指示菌均有抑制作用，抑制大腸桿菌作用最強的是菌株B4，抑菌圈直徑為15 mm，抑制金黃色葡萄球菌作用最強的是B17，抑菌圈直徑為14.5 mm，抑制蠟樣芽孢桿菌作用最強是菌株B4。共有14 株乳酸菌有抑菌作用，其中抑制大腸桿菌作用最強的是菌株L5，抑菌圈直徑為12.5 mm，抑制蠟樣芽孢桿菌作用最強的是菌株L11，抑菌圈直徑為13 mm，但均對金黃色葡萄球菌無抑制作用。有8 株 酵母菌被檢測到了抑菌活性，其中菌株Y2對大腸桿菌的抑菌作用最強，抑菌圈直徑達到18 mm。

表4 豆豉樣品中分離菌株的抑菌能力Table 4 Antibiotic abilities of the stains isolated from Douchi samples mm

表5 豆豉樣品中分離菌株的產酶能力Table 5 Enzyme production abilities of the stains isolated from Douchi samples mm

2.5 分離菌株的產酶能力

微生物在發酵中會產生豐富的酶系如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等，尤其是蛋白酶與發酵過程中多肽、氨基酸等的形成密切相關，這不僅可以提高發酵產品的消化吸收率及賦予抗氧化等生理功能，而且對產品風味物質形成具有重要影響[17-19]。因此，考察分離菌株的產酶能力對豆豉的發酵有一定的積極意義。本實驗對分離到菌株的分泌蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的能力分析結果見表5，有22 株芽孢桿菌具有較強的分泌蛋白酶的能力（透明圈直徑＞15 mm），但都不具備產脂肪酶的能力，有7 株菌具有分泌淀粉酶的能力，其中，菌株B7產蛋白酶的能力最強，透明圈直徑達到28 mm，產淀粉酶能力最強的菌株是B9，透明圈直徑也達到28 mm，但是有較強抑菌作用的菌株B4產蛋白酶的能力卻相對較弱。乳酸菌中僅有4 株具有產蛋白酶的能力，其中1 株有產淀粉酶的能力，但都不具有產脂肪酶的能力，菌株L4具有較強的產蛋白酶能力，透明圈直徑為23 mm。而所有酵母 菌均不具備產蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的能力（結果未列出）。

2.6 分離菌株的 耐鹽能力

食鹽在傳統發酵食品中扮演著十分重要的角色，主要作用就在于其具有抑制腐敗微生物延長發酵產品的保質期[20]。但是食鹽在抑制腐敗微生物的同時，也會對參與發酵過程的一些有益的微生物產生抑制作用。因此，考察分離菌株對食鹽的耐受能力有助于篩選適合的發酵菌株。本實驗對具有一定抑菌能力和產酶能力的菌株的耐受食鹽 能力進行研究，菌株在不同食鹽質量濃度下培養前后的OD差值見圖1。圖中OD差值為正值，表示培養后菌數增加，即菌株具有耐受能力而生長，反之則表明菌株生長受到了抑制，OD差值越大，說明其耐受食鹽的能力越強。由圖1可知，所有芽孢桿菌、乳酸菌和酵母菌菌株在5 g/100 mL NaCl中培養后菌數有不同程度的增長，其中芽孢桿菌菌株B19的耐受能力最強，乳酸菌的菌株L5耐受能力最強，酵母菌Y8的耐受能力最強。NaCl質量濃度在10 g/100 mL時，菌株B7、B10、B11和Y7的生長受到了抑制（OD差值為負值），而菌株B1、B19、B20、L10、L11和Y6具有較高的耐受能力。當NaCl質量濃度達到15 g/100 mL時，大多數菌株的生長 受到了抑制，所有酵母菌株都被抑制，僅有菌株B21、B22、L10和L11具有一定的耐受15 g/100 mL NaCl能力。

圖1 豆豉樣品中分離菌株在不同NaCl質量濃度條件下培養的OD差值Fig.1 OD values of yeast, Bacillus and LAB isolated from Douchi samples incubated in the presence of NaCl at various concentrations

2.7 分離菌株的耐溫能力

在傳統發酵豆制品如醬油、豆醬等的生產中，通常為了縮短發酵周期，保證發酵過程的安全進行，會考慮提高發酵的溫度（一般在40～50 ℃之間），并進行保溫發酵，但是較高的溫度會抑制一些有益微生物的繁殖[21]。因此，選擇具有較高耐溫性能的菌株，對改善發酵產品的品質，提高生產效率是十分有益的。因芽孢桿菌一般都能耐受較高的環境溫度，所以本實驗只對乳酸菌和酵母菌進行了耐溫能力檢驗，其在不同溫度下培養前后的OD差值見圖2，相對于酵母菌來講，所有乳酸菌都可以在35～40 ℃之間較好的生長，菌株L1、L3、L5、L6、L10、L11和L15耐受45 ℃高溫的能力較強。大多數酵母 菌在25～30 ℃之間生長良好，當培養溫度為40 ℃時，菌株Y3、Y4和Y7的耐受能力較強，而菌株Y1、Y2和Y8均已被抑制。

圖2 豆豉樣品中分離乳酸菌和酵母菌在不同溫度下培養的OD差值Fig.2 OD values of LAB and yeasts isolated from Douchi samples incubated in the presence of NaCl at various concentrations at various temperatures

3 結 論

本實驗從傳統豆豉后發酵中分離到了優勢有益酵母菌、芽孢桿菌以及乳酸菌，并針對豆豉后發酵的特點及菌株的生產性能，經過綜合篩選，根據優勢互補的原則，共篩選到6 株優勢有益菌株，經過對所篩選到的微生物進行分子生物學鑒定（數據未列出），并結合形態學和生理生化特性，鑒定菌株B4為枯草芽孢桿菌（B. subtilis），菌株B9為解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens），菌株L5為戊糖片球菌（P. pentosaceus），菌株L11為食竇魏斯氏菌（W. cibaria），菌株Y 3為東方伊薩酵母（I. orientalis），菌株Y 4為熱帶假絲酵母（C. tropicalis）。酵母菌和乳酸菌及部分芽孢桿菌如枯草芽孢桿菌等是共認的安全微生物[22]，因此上述分離到的菌株可以考慮作為有益菌株應用于豆豉的后發酵中。

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Screening and Production Performance of Predominant Strains during Douchi Post-fermentation

HU Hui-ping1, LIU Dan-chi1, YIN Li-jun2, CHENG Yong-qiang2, DING Li-xiao1
(1. College of Marine Engineering, Rizhao Polytechnic, Rizhao 276826, China; 2. Beijing Key Laboratory of Functional Food from Plant Resources, College of Food Science and Nutri tional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

Predominant strains of yeasts, Bacillus and lactic acid bacteria responsible for post-fermentation of Douchi were isolated and identified from selected commercial samples of Douchi such as “Beijing Xianju”. The production performance of the isolated strains was evaluated in terms of antimicrobial activity, enzyme production capacity, and s a lt and temperature tolerance. The screened strains were identified by molecular biology method as B. subtilis, B. amyloliquefacien, P. pentosaceus, W. cibaria, I. orientalis and C. tropicalis. This study has the potential to provide a theoretical reference for the development of Douchi fermentation starters.

Douchi; post-fermentation; predominant strains; production performance

TS201.3

A

1002-6630（2014）17-0146-07

10.75 06/spkx1002-6630-201417029

2013-08-20

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD34B03-4）；國家自然科學基金面上項目（31171739）；山東省高?？蒲邪l展計劃項目（J12LE55）

胡會萍（1976—），女，副教授，博士，研究方向為食品微生物發酵技術及功能食品。E-mail：huhuiping0316@163.com