產黃樟素內生真菌交鏈孢霉LJX27的發酵條件優化

徐 洲，尹禮國，張 超,*，魏 琴

產黃樟素內生真菌交鏈孢霉LJX27的發酵條件優化

徐 洲1,2，尹禮國1，張 超1,*，魏 琴2

（1.宜賓學院生命科學與食品工程學院，四川 宜賓 644000；2.發酵資源與應用四川省高校重點實驗 室，四川 宜賓 644000）

以巖桂內生真菌交鏈孢霉（Alternaria）LJX27為研究對象，通過單因素試驗研究各發酵工藝因素對黃樟素產量的影響，在此基礎上通過二次通用旋轉組合設計和響應面法優化黃樟素發酵工藝參數。結果表明：交鏈孢 霉LJX27在初始pH 8、發酵溫度 24 ℃、轉速200 r/min、培養5 d的條件下，黃樟素產量最高，達2.13 g/L，比優化前黃樟素的產量提高了67.72%。各因素對黃樟素產量的影響大小為初始pH值＞發酵時間＞發酵溫度＞轉速。該回歸模型可以用于優化黃樟素的發酵條件。

二次通用旋轉組合設計；巖桂；黃樟素；發酵條件

黃樟素又稱黃樟油素、黃樟腦，是合成胡椒基丁醚、洋茉莉醛、異丁香酚、香蘭素等系列產品的重要原料[1-2]，現已成為我國出口創匯的一種重要資源。由于以黃樟素為原料的市場需求量日益增加，其在國際貿易市場上長期處于供不應求的局面，致使近年來樟屬類植物，特別是針對黃樟樹的砍伐盜挖問題日趨嚴峻。為了保護植被，避免對生態環境的進一步破壞，各國先后制定限制刨取黃樟樹根的環境法規，巴西政府甚至嚴令禁止破壞黃樟樹的任何行為[2]。因此，在天然樟樹資源日趨枯竭的情況下，尋找一條替代天然樟屬植物產黃樟素的途徑已成為相關研究者的必然選擇。微生物因其具有繁殖速度快、發酵周期短、節能環保的優點，而備受研究者青睞，國內研究人員已經開始利用油樟內生真菌發酵生產黃樟素。

巖桂（Cinnamomum pauciflorum）是四川省宜賓市筠連縣、珙縣的一種特有的樟屬、樟科植物資源[3]，其中巖桂精油中黃樟素的比例高達90%～95%[4]。本課題組在前期研究工作中，從巖桂葉中分離得到了一株具有抑菌活性的交鏈孢霉屬（Alternaria）內生真菌LJX27，該菌對灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）有較強的抑制作用。進一步研究發現，LJX27能夠發酵產生一定量的黃樟素，但是在原有的實驗條件下黃樟素的產量偏少、發酵條件苛刻，有必要繼續深入研究和改良其發酵條件。

二次通用旋轉組合設計（quadratic general rotary unitized design）具有準確性高、綜合性好、系統性強、信息量大等優點，現已被廣泛應用于生產和科學實驗[5-6]。為了提高交鏈孢霉 LJX27產黃樟素的量，本實驗在單因素試驗的基礎上[7]，采用二次通用旋轉組合設計，考察各因素對交鏈孢霉 LJX27 發酵產黃樟素的影響，確定各因素的最佳水平并建立數學模型，以期為深層次利用該菌株產黃樟素提供技術參考和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 菌種、培養基與試劑

經18S rDNA序列分析技術鑒定為交鏈孢霉屬（Alternaria）的內生真菌LJX27，分離純化于四川省宜賓市筠連縣的巖桂葉，菌種保藏于發酵資源與應用四川省高校重點實驗室，發酵產黃樟素的量為1.27 g/L。

PDA固體培養基、葡萄糖硝酸銨液體培養基。

乙醚、鹽酸、磷酸二氫鉀、乙酸鈉、硝酸銨、硫酸鎂等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

GC7890F氣相色譜儀 蘭州中科安泰分析科技有限責任公司；HZQ-QX搖床培養箱 哈爾濱東聯電子技術開發有限公司；AR2130電子天平 美國奧豪斯儀器有限公司；DHG-9145A恒溫干燥箱 上海精密儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 孢子懸浮液制備

將在實驗室保藏的菌種LJX27轉接到PDA斜面培養基中，28 ℃條件下培養 72 h，隨后用無菌生理鹽水洗下PDA斜面培養基上的孢子，轉移到三角瓶中，用磁力攪拌器攪拌10 min，備用。

1.3.2 單因素試驗

1.3.2.1 發酵溫度對黃樟素產量的影響

在初始pH 6、轉速150 r/min、發酵時間5 d、接種量2%、裝液量100 mL條件下，測定不同發酵溫度（20、22、24、26、28 ℃）下黃樟素的產量。

1.3.2.2 接種量對黃樟素產量的影響

在發酵溫度22 ℃、初始 pH 6、轉速150 r/ min、發酵時間5 d、裝液量100 mL條件下，測定不同接種量（1%、2%、3%、4%、5%）下黃樟素的產量。

1.3.2.3 發酵時間對黃樟素產量的影響

在發酵溫度22 ℃、初始pH 6、接種量2%、轉速150 r/min、裝液量100 mL條件下，測定不同發酵時間（3、4、5、6、7 d）下黃樟素的產量。

1.3.2.4 初始pH值對黃樟素產量的影響

在發酵溫度 22 ℃、轉速150 r/min、發酵時間5 d、接種量2%、裝液量100 mL條件下，測定不同初始pH值（4、5、6、7、8）[8]下黃樟素的產量。

1.3.2.5 轉速對黃樟素產量的影響

在發酵溫度22 ℃、初始pH 6、發酵時間5 d、接種量2%、裝液量100 mL條件下，測定不同轉速（100、150、200、250、300 r/min）下黃樟素的產量。

1.3.3 響應曲面法優化發酵條件

在上述單因素試驗基礎上，在初始pH值、發酵溫度[9]、轉速、發酵時間和接種量5 個因素中選取4 個影響作用較大的因子，以黃樟素產量作為響應值，進行四因素二次通用旋轉試驗設計優化。

1.3.4 色譜條件

色譜柱為AE.SE-54（15 m×0.25 mm，0.33 μm），柱溫145 ℃，進樣溫度250 ℃，檢測器溫度280 ℃，進樣體積1 μL，定量方法為外標峰高法。

1.4 數據分析

采用DPS7.05數據處理系統進行方差分析、顯著性檢驗[10]，使用Design Expert 7.1.3軟件進行響應面法交互效應分析[11]。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 發酵溫度對黃樟素產量的影響

圖1 發酵溫度對菌株LJX27產黃樟素的影響Fig.1 Effect of fermentation tempe rature on the production of safrole

由圖1可知，溫度對黃樟素的產量有明顯影響。溫度太低不利于LJX27菌體的生長和代謝，溫度過高菌體易衰老而影響其代謝產物的積累。內生真菌LJX27的臨界溫度為24 ℃，當發酵溫度在20～24 ℃區間時，黃樟素產量隨溫度升高而增高，溫度達24 ℃時代謝產物產量達到最高，隨后產量隨溫度上升而降低。

2.1.2 接種量對黃樟素產量的影響

圖2 接種量對菌株LJX27產黃樟素的影響Fig.2 Effect of inoculum amount on the production of safrole

由圖2可知，不同接種量對黃樟素的產量具有較大的影響。接種量過少，菌體生長緩慢，產油量較低，隨著接種量的增加，黃樟素的量逐漸上升，當接種量為4%時，黃樟素產量達到最高，為1.21 g/L。之后隨著接種量進一步增大，黃樟素產量反而下降。這可能是由于發酵液中的營養物質主要用于菌體細胞增殖，有大量的代謝廢物生產[12]，抑制了菌體的進一步發酵產黃樟素。

2.1.3 發酵時間對黃樟素產量的影響

圖3 發酵時間對菌株LJX27產黃樟素的影響Fig.3 Effect of fermentation time on the production of safrole

由圖3可知，在一定時間范圍內，隨著培養時間的延長，黃樟素的產量也隨之逐漸增加，第3天到第6天增長速率較大，第6天時黃樟素產量達到最大值，為1.18 g/L，之后增長率很小，可以忽略。

2.1.4 初始pH值對黃樟素產量的影響

圖4 初始pH值對菌株LJX27產黃樟素的影響Fig.4 Effect of initial medium pH on the production of safrole

由圖4可知，發酵環境初始pH值對菌株LJX27產黃樟素有較大的影響。每種微生物都有其生長的最適宜pH值，pH值過高或過低都會導致菌體生長受阻，其主要原因是pH值會引起細胞膜電位的變化，從而影響微生物對營養物質的吸收[12]，進而引起產代謝產物能力的下降。pH值為7時黃樟素產量達最大值，為1.28 g/L，pH值為8時產量下降，為1.26 g/L。

2.1.5 轉速對黃樟素產量的影響

圖5 轉速對菌株LJX27產黃樟素的影響Fig.5 Effect of shaking speed on the production of safrole

菌株LJX27發酵產黃樟素需要氧氣，培養過程中增大轉速會影響發酵液的通氣量，進而增加培養基的溶氧水平[13]。由圖5可知，轉速為200 r/min時黃樟素產量最大達1.13 g/L，轉速為 250 r/min時黃樟素產量基本保持不變，但繼續增大轉速，黃樟素的產量反而有所降低，可能是由于轉速增大的同時，剪切力也隨著增大，過大的剪切力會將菌絲切斷，影響了霉菌的生長與產酶[13]。

2.2 黃樟素發酵條件優化

2.2.1 二次通用旋轉回歸組合設計試驗

根據以上單因素試驗結果，在考察的5 種影響因子中，接種量對菌株LJX27產黃樟素的影響最小，因此選取初始pH值（X1）、發酵溫度（X2）、轉速（X3）和發酵時間（X4）為自變量，以黃樟素產量為響應指標，利用DPS7.05進行四因素五水平的二次通用旋轉組合設計試驗，優化工藝參數。試驗設計及結果見表1。

表1 二次通用旋轉回歸組合設計試驗及結果Table 1 Quadric general rotational composite design with experimental values of safrole production

續表1

2.2.2 模型建立與方差分析

表2 方差分析表Table 2 Analysis of variance for the experimental results of safrole production

采用DPS7.05數據處理系統對試驗數據進行擬合，計算各項回歸系數，得到黃樟素產量與4 個因素的數學回歸模型：

Y = 1.650 00+0.335 83 X1-0.045 00 X2-0.030 00 X3+ 0.117 50 X4-0.002 92 X12-0.120 42 X2

2-0.080 42 X3

2-0.067 92 X4

2+0.013 75 X1X2+0.018 75 X1X3-0.035 00 X1X4+ 0.075 00 X2X3-0.056 25 X2X4-0.053 75 X3X4（1）

由表2可知，發酵溫度、 轉速、發酵時間二次項偏回歸系數均達極顯著水平（P＜0.01），說明各個影響因素與響應值不是簡單的線性關系。通過查F分布表得知，回歸方程的失擬檢驗F= 6.972 31＞F0.05（11,6）=3.09差異顯著，而回歸方程的擬合檢驗F=27.527 70＞F0.01（15,6）= 4.32極顯著，說明方程與實際情況擬 合良好，模型的預測值與實際值吻合較好，模型成立。

2.2.3 數學模型解析

2.2.3.1 主因子效應分析

由回歸模型方程可知：一次項中的X1和X4的系數大于零，X2和X3的系數小于零。一次項系數絕對值大小反映了該因素對產量影響程度的強弱[14-15]，對模型進行主效應分析，得到各個因素對菌株LJX27產黃樟素的影響大小次序為：初始pH值＞發酵時間＞發酵溫度＞轉速。

2.2.3.2 單因子效應分析

將4 個因素中的其中3 個固定在0水平，對數學模型進行降維分析，得到以其中1 個因素為決策變量的偏回歸模型：

上述4 個方程中，二次項的系數均為負值，說明其表征的拋物線都開口向下，因此，4 個因素取值均存在最佳值，過大或過小均會使響應值降低[5]。

2.2.3.3 響應面圖及等高線圖分析

對模型的方差分析表明，交互項中僅有因素X2X3對黃樟素產量影響極顯著（P＜0.01），而其他交互項均未達到極顯著水平。由于二次項系數之間具有相關性，因此這些微弱的交互項，原則上不能刪除[16]。因而在其他因素條件固定不變的情況下，只需要探討X2（發酵溫度）與X3（轉速）交互作用對菌株LJX27產黃樟素的影響，采用Design Expert 7.1.3對模型進行降維分析[17]。

等高線的形狀可以反映因素間交互作用的大小，圓形表示交互作用不顯著，橢圓形表示交互作用顯著[18-19]。由圖6可知，發酵溫度與轉速存在一定的交互作用[20]。當發酵溫度一定時，隨著轉速的增加，黃樟素產量先升高后降低，在200 r/min達到最大值；當轉速一定時，隨著發酵溫度的增加，黃樟素產量也是先升高后降低，在24 ℃時達到最大值。

通過Design Expert 7.1.3軟件分析，得到內生真菌LJX27產黃樟素的最佳發酵條件為：初始pH 8、發酵溫度24 ℃、轉速200 r/min、發酵時間5 d，得到黃樟素最大產量為2.13 g/L。為了進一步驗證模型的可靠性，在最佳發酵條件下，進行了驗證實驗，得到產黃樟油素產量為2.24 g/L，實際值與模型最優值的比值為1.06（＞1），說明本實驗獲得的二次通用旋轉組合的最佳模型是可靠的。

圖6 發酵溫度與轉速交互作用的響應面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots for the interactive effect of fermentation temperature and shaking speed on the production of safrole

3 結論與討論

本研究通過單因素試驗篩選出對黃樟素發酵影響較大的4 個因素，并對這4 個因素進行了二次通用旋轉組合試驗優化，獲得內生真菌 LJX27發酵產黃樟素的最佳條件為初始pH 8、發酵溫度24 ℃、轉速200 r/min、發酵時間5 d，在此條件下黃樟素產量達 2.13 g/L，比優化前黃樟素的產量提高了67.72%。各因素對黃樟素產量的影響大小依次為：初始pH值＞發酵時間＞發酵溫度＞轉速；響應面試驗得出發酵溫度與轉速有一定的交互作用。試驗所建立的回歸模型經顯著性檢驗達到顯著水平，說明該模型用于內生真菌 LJX27產黃樟素發酵條件的優化是可行的。

在檢測方法上，本研究采用的是氣相色譜法，以黃樟素標準樣品比對進行檢測。由于內生真菌發酵液中的成分復雜，其極性也各不相同，測定值可能存在一定的誤差，可以采用氣相色譜-質譜聯用法做進一步檢測和驗證。以黃樟素為原料的市場需求量較大，四川省宜賓市的巖桂資源優勢突出，本研究結果能夠為巖桂內生真菌 LJX27進一步放大培養產黃樟素提供基礎數據，可以結合地方特色巖桂產業進行更深入的研究和應用。

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Optimization of Fermentation Conditions of Alternaria LJX27 for Safrole Production

XU Zhou1,2, YIN Li-guo1, ZHANG Chao1,*, WEI Qin2
(1. College of Life Science and Food Engineering, Yi Bin University, Yibin 644000, China; 2. Key Laboratory of Fermentation Resource and Application o f Institutes of Higher Learning in Sichuan Province, Yibin 644000, China)

The objective of this study was to optimize fermentation conditions of Alternaria LJX27 (an endophytic fungus from Cinnamomum paucifl orum) for enhanced production of safrole by response surface methodology with quadratic general rotary composite design. The production of safrole was investigated with respect to fermentation conditions including inoculum amount, pH, fermentation temperature, fermentation time and shaking speed. Fermentation experiments performed under the optimal conditions: medium pH 8; temperature, 24 ℃; shaking speed, 200 r/min; and incubation time, 5 d; resulted in maximum production of 2.13 g/L, which was 67.72% higher than that obtained before optimization. Safrole production was affected in decreasing order by initial medium pH, fermentation time, fermentation temperature and shaking speed. Our investigations indicated that the developed regression model was applicable for optimizing the fermentation conditions for safrole production.

quadratic general rotary composite design; Cinnamomum paucifl orum; safrole; fermentation condition

TS201.3

A

1002-6630（2014）17-0165-05

10.7506/spkx1002-6630-201417032

2014-05-30

四川省科技廳應用技術研究與開發項目（2009JY0057）；宜賓學院科研啟動經費項目（2009Q27）；四川省高校科研創新團隊建設資助項目（14TD0031）

徐洲（1984—），男，講師，博士研究生，研究方向為發酵工程。E-mail：zhxu23@126.com

*通信作者：張超（1966—），男，教授，博士研究生，研究方向為發酵工程。E-mail：chzh6122@126.com