多不飽和脂肪酸對(duì)大鼠腸道菌群及脂肪代謝相關(guān)基因的影響

喬立君，鄭 征，馬文慧，蘆庭秀，蓋曉英，葛銀林

多不飽和脂肪酸對(duì)大鼠腸道菌群及脂肪代謝相關(guān)基因的影響

喬立君，鄭 征，馬文慧，蘆庭秀，蓋曉英，葛銀林*

（青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，山東 青島 266021）

目的：研究多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fat acids，PUFA）飲食對(duì)大鼠腸道菌群及相關(guān)脂肪因子的影響，探討其作用機(jī)理。方法：將30 只5 周齡健康大鼠分為正常對(duì)照組、n-6 PUFA組和n-3 PUFA組，自由攝食飲水8 周，每周記錄大鼠體質(zhì)量，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)取大鼠盲腸糞便和肝臟，用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)雙歧桿菌（Bifi dobacterium，Bif）、乳酸桿菌（Lactobacillus，Lac）、腸道細(xì)菌Akkermansia muciniphila（Akk）和脂肪因子脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，F(xiàn)AS）、禁食誘導(dǎo)脂肪因子（fasting-induced adipose factor，F(xiàn)IAF）的水平；并將大鼠盲腸石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅染色測(cè)量其黏膜厚度。結(jié)果：n-3 PUFA組與正常對(duì)照組相比，肥胖程度和FAS水平明顯降低（P＜0.05），Bif、Lac、Akk和FIAF水平明顯升高（P＜0.05），腸道黏膜厚度明顯增加；n-6 PUFA組大鼠的各項(xiàng)指標(biāo)和正常對(duì)照組相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論：n-3 PUFA飲食與n-6 PUFA飲食相比，可改變腸道菌群，抑制肥胖的發(fā)生和發(fā)展。

n-3多不飽和脂肪酸；肥胖；Akkermansia muciniphila；腸道黏膜

肥胖是指一定程度的明顯超重與脂肪層過(guò)厚，是體內(nèi)脂肪，尤其是甘油三酯積聚過(guò)多而導(dǎo)致的一種狀態(tài)。由于食物攝入過(guò)多或機(jī)體代謝的改變而導(dǎo)致體內(nèi)脂肪積聚過(guò)多，造成體質(zhì)量過(guò)度增長(zhǎng)并引起人體病理、生理改變或潛伏。歷年來(lái)，肥胖一直是人們急需解決的問(wèn)題。有不少研究證明，魚(yú)油中的n-3多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fat acids，PUFA）可對(duì)脂肪因子產(chǎn)生影響，有一定的減肥作用。n-3 PUFA，尤其是二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）具有很強(qiáng)的生理活性，對(duì)人和動(dòng)物的多種疾病，如癌癥等具有特殊的預(yù)防和治療效果，是一種重要的免疫調(diào)理性營(yíng)養(yǎng)素。n-3 PUFA作為 一種特殊的腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)素，可以減輕腸道黏膜損傷，促進(jìn)腸道炎癥愈合，對(duì)腸道具有保護(hù)作用，但關(guān)于其對(duì)腸道微生態(tài)影響方面的文獻(xiàn)報(bào)道并不多。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantity real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）方法，觀察n-3 PUFA對(duì)實(shí)驗(yàn)組大鼠腸道菌群和脂肪因子的影響，探討魚(yú)油對(duì)大鼠腸道生物屏障的影響，為n-3 PUFA作為防治腸道相關(guān)疾病的營(yíng)養(yǎng)素提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

SPF級(jí)Wistar雌性大鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。

標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料 濟(jì)南康大飼料有限公司；脫脂甜奶粉 瑞士雀巢公司；脫脂大豆粉 青島美辰食品公司；深海魚(yú)油 美國(guó)康隆公司；維生素A、D膠丸青島雙鯨藥業(yè)有限公司；其他試劑均為分析純。

各組飼料配方參照本實(shí)驗(yàn)室飼料制備配比見(jiàn)表1，飼料制備后4 ℃低溫保存。

表1 各組飼料成分配方Table 1 Ingredients of rat diets

1.2 儀器與設(shè)備

DW-86L626超低溫冰箱、BCD-196TE冰箱 青島海爾公司；SIGMA 1-13離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；PYXDHS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；RG-3000熒光定量PCR儀 英國(guó)Corbett Research公司；RM2235切片機(jī) 德國(guó)萊卡公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

30 只SPF級(jí)5 周齡雌性Wistar大鼠，體質(zhì)量100～120 g，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、n-3 PUFA組和n-6 PUFA組。正常對(duì)照組體質(zhì)量為（116.40±0.10）g；n-3 PUFA組體質(zhì)量為（109.33±0.28）g；n-6 PUFA組體質(zhì)量為（115.62±0.52）g。每組分為3 籠，自由攝食飲水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房溫度（22±5）℃，相對(duì)濕度（50±10）%，明暗周期12 h/12 h。每周記錄每只大鼠的體質(zhì)量。第8周末時(shí)注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛，處死大鼠，記錄每只大鼠肛門到鼻尖的長(zhǎng)度作為體長(zhǎng)，無(wú)菌條件下取大鼠腸道糞便分裝于滅菌的5 mL離心管中，于-70 ℃保存。取大鼠肝臟于-70 ℃保存，取大鼠回腸、結(jié)腸、盲腸浸入體積分?jǐn)?shù)為10%的甲醛固定24 h，進(jìn)行石蠟包埋、切片，以備蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色。

1.3.2 糞便樣品的處理及腸道細(xì)菌總DNA的提取

糞便樣品處理參照參考文獻(xiàn)[1]。處理好的樣品于-20 ℃保存。

腸道細(xì)菌總DNA的提取采用十六烷基三甲基溴化銨法（hexadecyltrimethy ammonium bromide，CTAB）法提取，具體步驟參照參考文獻(xiàn)[2]。提取的DNA于-20 ℃保存。

1.3.3 肝臟總RNA提取

稱取50～100 mg肝臟組織，用Trizol（TaKaRa）提取，按試劑盒步驟進(jìn)行。提取的總mRNA用Roche反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA的合成。

1.3.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物

雙歧桿菌（Bifidobacterium，Bif）、乳酸桿菌（Lactobacillus，Lac）引物參照參考文獻(xiàn)[3]，腸道細(xì)菌Akkermansia muciniphila（Akk）引物參照參考文獻(xiàn)[4]，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；禁食誘導(dǎo)脂肪因子（fasting-induced adipose factor，F(xiàn)IAF）和脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，F(xiàn)AS）引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)并合成，見(jiàn)表2。

表2 各引物序列Table 2 Sequence of primers used in this study

1.3.5 實(shí)時(shí)定量PCR

腸道菌群的實(shí)時(shí)定量PCR。25 μL反應(yīng)體系包括：12.5 μL SYBR Premix Ex Taq（Roche），200 nmol/L引物，1 μL DNA樣品。Bif、Lac反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，Akk退火溫度為60 ℃。每個(gè)樣本重復(fù)3 次，以2-ΔΔCt表示樣本中mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

以提取的DNA樣本為模板，用各基因的特殊引物（表2）進(jìn)行普通PCR，得到PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA片段純化試劑盒純化后與T載體連接，構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌。質(zhì)粒用DNA提取試劑盒提取后作為qRT-PCR的對(duì)照。

脂肪基因的實(shí)時(shí)定量PCR。25 μL反應(yīng)體系包括：12.5 μL SYBR Premix Ex Taq（Roche），200 nmol/L引物，500 ng RNA樣品。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，每個(gè)樣本重復(fù)2 次，以2ΔΔ-Ct表示樣本中mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.6 HE染色測(cè)量腸道黏膜厚度

取近結(jié)腸處約1 cm長(zhǎng)，固定在體積分?jǐn)?shù)為10%的甲醛溶液中24 h后，用磷酸鹽緩沖液清洗24 h，分別浸入55%、65%、75%、85%、95%、100%乙醇中脫水，再放入二甲苯中，之后浸蠟包埋，切片進(jìn)行HE染色。每個(gè)部位最少測(cè)量與黏液層垂直的20 個(gè)厚度值，隨機(jī)選取每個(gè)結(jié)腸的5 個(gè)部位，用圖像分析系統(tǒng)（Image-Pro Plus 6.3）測(cè)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果以x±s表示，采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）對(duì)每周體質(zhì)量增加量、體質(zhì)量/體長(zhǎng)等作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用t檢驗(yàn)進(jìn)行各組間的兩兩比較。顯著性水平設(shè)為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 體質(zhì)量、體長(zhǎng)的測(cè)定結(jié)果

圖1 3 組大鼠每周體質(zhì)量平均增加量和體質(zhì)量/體長(zhǎng)Fig.1 Comparisons of average body weight and weight/length ratio between rats fed high fat diet and those fed n-3 or n-6 PUFA-containing diet or common diet

由圖1可知， 3 組大鼠的每周體質(zhì)量增加量的平均值（F=5.374，P=0.013＜0.05）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；n-3 PUFA組大鼠的每周體質(zhì)量增加量的平均值顯著低于正常對(duì)照組（P＜0.05）；n-3 PUFA組的體質(zhì)量/體長(zhǎng)值增加趨勢(shì)緩慢。n-6 PUFA組和正常對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異。表明n-3 PUFA組大鼠的肥胖程度顯著低于另外兩組。

2.2 實(shí)時(shí)定量結(jié)果

2.2.1 腸道菌群結(jié)果

圖2 3 組大鼠種腸道菌群的變化Fig.2 Changes in gut microbiota between rats fed high fat diet and those fed n-3 or n-6 PUFA-containing diet or common diet

由圖2可知，n-3 P U FA組和正常對(duì)照組相比，Bif、Lac和Akk均顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.229，P=0.047 6＜0.05；t=2.653，P=0.021 0＜0.05；t=1.680，P=0.001 3＜0.05）；而n-6 PUFA組的Bif雖也有所增加，但與正常對(duì)照組相比，二者之間仍無(wú)顯著性差異（P=0.099 6）；n-6 PUFA組中Akk變化量低于正常對(duì)照組，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.121 2）。

2.2.2 肝臟脂肪代謝相關(guān)基因結(jié)果

圖3 肝臟中2 種脂肪因子的變化Fig.3 Changes in liver adi pocytokines

由圖3可知，3 個(gè)組FAS mRNA和FIAF mRNA之間的相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.391，P=0.023 7＜0.05；F=4.094，P=0.029 5＜0.05）；n- 3PUFA組FIAF與正常對(duì)照組相比表達(dá)量增加（P=0.040 3＜0.05），與n-6 PUFA組相比無(wú)顯著性差異（P=0.0572）；n-3 PUFA組FAS表達(dá)量減少與正常對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.041 1＜0.05）；而n-6 PUFA組FAS表達(dá)量增加，和正常對(duì)照組相比有顯著性差異（P=0.010 3＜0.05）。

2.3 腸道黏膜厚度

由圖4可知，在100×顯微鏡下獲取圖片，用圖像分析儀測(cè)量各組結(jié)腸腸道黏膜的厚度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=14.10，P＜0. 01）；n-3 PUFA組與正常對(duì)照組相比厚度增加（P=0.003 4＜0.05）；而n-6 PUFA組和正常對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異（P=0.056 0）。

圖4 3 組腸道黏膜厚度的比較Fig.4 Comparison of intestinal mucus thickness among three groups

3 討 論

近年來(lái)，n-3 PUFA對(duì)健康的影響越來(lái)越受到人們的重 視。n-3 PUFA是一類重要的多不飽和脂肪酸，主要包括EPA、DHA、二十二碳五烯酸、二十碳四烯酸、α-亞麻酸（alpha-linolenic acid，ALA）。其中EPA和DHA的營(yíng)養(yǎng)保健作用最有效。攝入一定量的EPA和DHA可以降低肥胖成年人體內(nèi)的脂肪含量，促進(jìn)脂肪的利用[5]；增強(qiáng)2型糖尿病患者體內(nèi)胰島素的敏感性，緩解胰島素抵抗性[6]，顯著降低糖尿病患者血清甘油三酯和血脂水平[7]。本實(shí)驗(yàn)中，長(zhǎng)期給大鼠喂食添加n-3 PUFA的食物后，可有效地控制其肥胖的發(fā)生，降低其肥胖程度，說(shuō)明EPA和DHA對(duì)大鼠有減肥作用，該結(jié)果與相關(guān)報(bào)道一致[5]。

腸道菌群結(jié)構(gòu)對(duì)維持腸道內(nèi)環(huán)境平衡起著非常重要的作用，人體是否健康與腸道內(nèi)的益生菌群結(jié)構(gòu)息息相關(guān)，因此，人體在正常情況下，菌群結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，對(duì)宿主表現(xiàn)為不致病。相反，如果腸道菌群失調(diào)，會(huì)引起各種疾病。有研究指出，有益菌的比例在體格強(qiáng)健的人腸道內(nèi)達(dá)到70%，普通人則是25%，便秘人群減少到15%，而在癌癥病人腸道內(nèi)的比例只有10%。近年來(lái)，隨著相關(guān)研究論文的發(fā)表，腸道菌群與腸道內(nèi)環(huán)境平衡和疾病的關(guān)系逐步清晰。有證據(jù)表明，腸道菌群可以調(diào)控脂肪代謝、引發(fā)低度慢性炎癥[8]和破壞腸道屏障[9-11]，可以導(dǎo)致胰島素抵抗和肥胖癥的發(fā)生[12-13]。腸道菌群對(duì)腸黏膜系統(tǒng)的機(jī)械屏障、免疫屏障與生物屏障有調(diào)控作用。腸道中的大腸桿菌可以通過(guò)上調(diào)緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)，減輕腸上皮的通透性[14]。乳酸桿菌可以對(duì)病原菌的定殖產(chǎn)生阻抗作用[15]，能較好地恢復(fù)小鼠的腸黏膜免疫屏障功能[16]。雙歧桿菌可以有效減少乳糜瀉患者中由小麥醇溶蛋白引起的結(jié)腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜皺褶[17]，從而調(diào)控腸道的機(jī)械屏障。腸道菌群會(huì)隨著飲食的變化而變化，研究表明，飲食是決定腸道菌群構(gòu)成的最重要因素。因此，通過(guò)改變飲食，可以讓引起肥胖、糖尿病[18]、冠心病[19]的菌群結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常，從而為預(yù)防、緩解甚至逆轉(zhuǎn)這些疾病帶來(lái)新的希望。本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)檢測(cè)n-3、n-6 PUFA對(duì)大鼠腸道菌群的影響發(fā)現(xiàn)，n-3 PUFA可以增加腸道內(nèi)一些益生菌如Bif、Lac、Akk的含量，從而影響大鼠腸道內(nèi) 的菌群環(huán)境，改善大鼠的體內(nèi)微環(huán)境，調(diào)控腸道的屏障功能。

Akk是一種革蘭氏陰性菌，是疣微菌門的一種。近日，Akk被確定為駐留在黏液層的黏蛋白降解細(xì)菌，并且它在營(yíng)養(yǎng)豐富的環(huán)境中的人類細(xì)菌中占主導(dǎo)地位[20]。最新研究表明，Akk是一種減肥細(xì)菌，益生元（低聚果糖）能促進(jìn)其在腸 道內(nèi)的豐富度。它通過(guò)增加腸道黏膜的厚度來(lái)提高腸道黏膜屏障功能，維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)和提高脂肪組織代謝。在飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠中Akk能改善代謝混亂，增加回腸中內(nèi)源性大麻素的水平，抵消肥胖中飲食引起的結(jié)腸黏膜屏障的功能紊亂[18]。在本實(shí)驗(yàn)中，n-3 PUFA組大鼠的腸道黏膜厚度顯著高于另外2 組，這可能與腸道菌群Akk的含量有關(guān)。進(jìn)一步說(shuō)明，n-3 PUFA可能通過(guò)改善腸道菌群，增加黏膜厚度，來(lái)提高腸道黏膜屏障功能。

FAS是脂肪酸合成的主要限制酶，它在乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A從頭合成長(zhǎng)鏈脂肪酸的過(guò)程中起催化作用。有研究指出，n-3 PUFA不僅能在蛋白水平抑制FAS的活性[21]，而且還能在轉(zhuǎn)錄水平抑制FAS基因的表達(dá)[22-23]。另外，相關(guān)研究表明，腸道菌群作為內(nèi)化了的環(huán)境因子，可以直接調(diào)控動(dòng)物的基因表達(dá)，它們可以增強(qiáng)肝臟合成脂肪的基因FAS的活性，同時(shí)關(guān)閉腸道內(nèi)抑制脂肪積累的基因FIAF[24]。FIAF也稱為血管生成素樣蛋白4，是過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體的新靶點(diǎn)[25]，是一種新的下丘腦調(diào)節(jié)器，它可以調(diào)節(jié)食物的攝取，從而影響體質(zhì)量[26]。本實(shí)驗(yàn)中，n-3 PUFA組FAS表達(dá)量減少，F(xiàn)IAF表達(dá)量增加，可能一方面通過(guò)n-3 PUFA直接影響基因的轉(zhuǎn)錄，另一方面可能通過(guò)n-3 PUFA影響腸道菌群的量來(lái)間接影響基因的合成。這說(shuō)明n-3 PUFA可能從多方面影響基因合成，從而達(dá)到減肥的目的。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)討論了n-3 PUFA對(duì)腸道菌群的影響及其對(duì)肥胖的抑制作用的可能途徑。這些結(jié)果提示n-3 PUFA可能通過(guò)改變腸道菌群中的有益菌，特別是Akk，改善腸道微環(huán)境，增加腸黏膜厚度，提高腸道黏膜屏障功能，并通過(guò)控制脂肪代謝相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)達(dá)到減肥的目的。同時(shí)，為人類使用這種腸道細(xì)菌用于預(yù)防或治療肥胖癥和其相關(guān)的代謝紊亂提供了新的治療方法。

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Effect of PUFA-Containing Diet on Gut Microbiota and Fat Metabolism-Related Genes in Rats

QIAO Li-jun, ZHENG Zheng, MA Wen-hui, LU Ting-xiu, GAI Xiao-ying, GE Yin-lin*
(Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medical, Qingdao University, Qingdao 266021, China)

Purpose: To determine the effect of PUFA diet on gut microbiota and obesity-related cell factors in rats. Me thods: A total of 30 five-week-old healthy female rats were randomly divided into three groups: control group, n-6 PUFA-containing diet group and n-3 PUFA-containing diet group. The rats had free access to the feeds and water for eight weeks. Body weight was recorded once a week during the trail period and the levels of Bifi dobacterium (Bif), Lactobacillus (Lac), Akkermansia muciniphila (Akk) and obesity-related cell factors, fatty acid synthetase (FAS) and fasting-induced adipose factor (FIAF) were evaluated by qRT-PCR at the end of the trial. Results: The adiposity and FAS level in the n-3 PUFA-containing diet group were significantly lower than that in the control group (P ＜ 0.05), and the levels of Bif, Lac, Akk and FIAF, and the thickness of the intestinal mucosa in the n-3 PUFA-containing diet model group were significantly higher than those in the control group (P ＜ 0.05). Conclusion: An obvious change in gut microbiota was observed in rats fed n-3 PUFA-containing diet; meanwhile the occurrence and development of adiposity were inhibited.

n-3 PUFA; obesity; Akkermansia muciniphila; intestinal mucosa

R378

A

1002-6630（2014）17-0231-05

10.7506/spkx1002-6630-201417044

2013-10-12

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ZR2010CM010）

喬立君 （1988—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)榛蛑委煛-mail：qlj19880728@163.com

*通信作者：葛銀林（1957—），男，教授，博士，研究方向?yàn)榛蛟\斷與治療。E-mail：geyinlin@126.com