高劑量蘇氨酸鋅和硫酸鋅對大鼠胚胎-胎仔發(fā)育毒性的比較

馮建萍，王光然，胡曉波，姜雯雯，謝明勇

高劑量蘇氨酸鋅和硫酸鋅對大鼠胚胎-胎仔發(fā)育毒性的比較

馮建萍，王光然，胡曉波，姜雯雯，謝明勇*

（南昌大學 食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

目的：在胎鼠器官形成期6～15 d對懷孕的Sprague-Dawley（SD）大鼠連續(xù)灌胃高劑量鋅源，觀察蘇氨酸鋅和硫酸鋅對S D大鼠胚胎-胎仔發(fā)育毒性。方法：將蘇氨酸鋅按1 200 mg/（kg·d）的劑量（以體質(zhì)量計，下同），硫酸鋅則給予相同劑量的鋅（575 mg/（kg·d））， 于妊娠第6～15天連續(xù)灌胃給藥，觀察孕鼠基本生活狀況。每隔3 d稱1次體質(zhì)量，妊娠第20天處死孕鼠，記錄子宮質(zhì)量、著床 數(shù)、死胎數(shù)、胎盤質(zhì)量及胎鼠體質(zhì)量等，觀察活胎仔外觀異常與否。每窩1/2 胎鼠 放入Bouin’s液固定兩周作內(nèi)臟檢查，另1/2 胎鼠作骨骼畸 形檢查。結(jié)果：蘇氨酸鋅和硫酸鋅組部分孕鼠給藥初期均出現(xiàn)食欲低下，毛發(fā)不順等，且攝食量明顯降低（P＜0.05），實驗結(jié)束時孕鼠體質(zhì)量增加顯著減少（P＜0.05）。蘇氨酸鋅組有18 例胎鼠胸骨缺失，與玉米油組比較有顯著差異（P＜0.0 5）。硫酸鋅組有13 例胎鼠胸骨缺失，同時有2 只孕鼠死亡，與玉米油組比較有顯著差異（P＜0.05）。結(jié)論：兩種高劑量的鋅源對SD孕鼠都有一定的生殖毒性，但蘇氨酸鋅相對比較安全。

蘇氨酸鋅；硫酸鋅；骨骼畸形；發(fā)育毒性

鋅是生物所必需的一種微量元素，對生物的生長發(fā)育、免疫功能等起著重要的作用[1-5]。鋅添加劑有3 種形式，第1代是無機鋅，如硫酸鋅；第2代是有機酸鋅，如葡萄糖酸鋅；而氨基酸微量元素則屬于第3代，它是鋅化合物和氨基酸按照一定的比例螯合成的有機微量元素螯合物。大量研究表明氨基酸鋅微量元素較無機鋅和有機酸鋅鹽比較，具有穩(wěn)定性好、生物效價高、易被消化吸收等特點[6-9]。蘇氨酸鋅是氧化鋅和蘇氨酸螯合成的一種新型的有機微量元素添加劑[10-11]，它在動物飼養(yǎng)方面顯示了優(yōu)良的補鋅與促進生長發(fā)育的作用[12-14]，在控制血糖方面也表現(xiàn)出了降血糖作用優(yōu)于硫酸鋅的功效[15]。蘇氨酸鋅作為第3代微量元素添加劑，因為其有適口性好、生物效價高等特點被推廣使用。有文獻[16]報道，蘇氨酸鋅的雌性大鼠急性LD50為2 710 mg/kg。

目前人們對氨基酸螯合物提高生產(chǎn)性能的研究比較多，而毒性方面研究的較少。丁小波等[17]綜述了微量元素鋅的毒性，長期或大量地服用硫酸鋅，大約有15%的人會出現(xiàn)不良反應(yīng)，嚴重者可引起貧血，出現(xiàn)胃出血等。一般來說，有機鋅會比無機鋅更容易吸收，因此更容易導致機體中毒。如果補鋅過多，不僅會抑制機體的生長發(fā)育和降低其免疫能力，還會引起雄性的不育。研究表明，蘇氨酸鋅具有吸收效率高、生物效價高等特點，實驗就蘇氨酸鋅的胚胎毒性進行基礎(chǔ)研究，通過對SD大鼠胚胎器官形成期連續(xù)給藥，進行致畸實驗，旨在比較蘇氨酸鋅和硫酸鋅兩種高劑量鋅源對SD孕鼠胚胎毒性的大小，為其安全應(yīng)用提供合理依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

硫酸鋅，白色結(jié)晶性粉末，易溶于水，純度≥99.5%，主要雜質(zhì)為鉀、鎂等一些微量元素；蘇氨酸鋅為實驗室自制，是由蘇氨酸和氧化鋅采用水熱化學合成法制備的一種氨基酸鋅螯合物，其化學式為C8H16N2O6Zn·2H2O，鋅含量為19.36%[18]。蘇氨酸鋅的結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 蘇氨酸鋅的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of zinc threoninate

1.1.2 試劑

氫氧化鉀 天津市大茂化學試劑廠；2,4,6-三硝基苯酚 廣東省臺山市化工廠；95%冰乙酸、質(zhì)量分數(shù)40%甲醛、丙三醇 西隴化工股份有限公司；食用玉米油 益海嘉里食品營銷有限公司；茜素紅 美國Sigma公司；所用試劑除特別說明外，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1004型電子分析天平 上海上平儀器公司；DT1000A型電子天平 常熟市意歐儀器儀表公司；HH-4型恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物及處理

選用成年未經(jīng)產(chǎn)的8 周齡大小Sprague-Dawley（SD）大鼠，雌鼠24 只，體質(zhì)量為250～300 g；雄鼠12 只，體質(zhì)量為380～420 g，購自常州卡文斯實驗動物有限公司，常規(guī)喂養(yǎng)，飼料中的鋅含量為139 mg/kg，自由飲食，自由飲水，室溫（20～25 ℃），每天12 h光照，12 h黑暗，換氣次數(shù)為10～15 次/h。動物健康，符合實驗動物所需要的質(zhì)量要求。

SPF級的SD大鼠先適應(yīng)環(huán)境7 d后開始實驗。選取健康的雌雄大鼠每天晚上20：00按1∶1合籠，次日早晨檢查陰栓。查出陰栓，則認為該大鼠已受孕，記為妊娠第0天。如果5 d內(nèi)某只雌鼠未受孕，則更換雄鼠。每天檢出的孕鼠隨機分為4 組，即蘇氨酸鋅組、硫酸鋅組、玉米油組和空白組，每組6 只。實驗組大鼠于孕期第6～15天連續(xù)灌胃，蘇氨酸鋅組按照1 200 mg/kg（以體質(zhì)量計，下同）給予蘇氨酸鋅，硫酸鋅組則給予相同劑量的鋅（575 mg/kg），每天灌胃1 次，劑量為1.5 mL/100 g，玉米油組和空白組也按劑量為1.5 mL/100 g給予玉米油和雙蒸水。并在受孕的0、4、8、12、16、20 d稱體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量重新調(diào)整灌胃的劑量。

1.3.2 觀測指標

于妊娠第20天斷頸處死孕鼠，取出子宮并稱質(zhì)量，記錄著床數(shù)、活胎數(shù)、吸收胎數(shù)，逐個檢查胎鼠有無外觀異常，稱胎鼠體質(zhì)量、胎盤質(zhì)量，量體長。在胚胎-胎仔發(fā)育毒性實驗中，著床數(shù)、活胎數(shù)、吸收胎數(shù)等指標通常是衡量胚胎早、晚期發(fā)育毒性的指標，胎鼠、胎盤的質(zhì)量以及胎鼠的身長、尾長數(shù)值等也是評價外來受試物對胎鼠是否產(chǎn)生毒性的指標。將1/2胎鼠放于Bouin’s液中固定，兩周后切片進行內(nèi)臟切片檢查。另外1/2胎鼠剝皮后用茜素紅液染色，并經(jīng)透明液脫色透明后檢查骨骼發(fā)育情況。

1.4 數(shù)據(jù)處理

以Excel軟件建立數(shù)據(jù)庫，SPSS 19.0軟件統(tǒng)計分析。胎鼠體質(zhì)量及每窩產(chǎn)仔數(shù)采用單因素方差分析和LSD-t法兩兩比較；胎鼠骨骼畸形率采用多個樣本比較及兩兩比較的秩和檢驗（Kruskal Wallis檢驗）。

2 結(jié)果與分析

2.1 對孕鼠一般狀況及體質(zhì)量的影響

灌胃期間，蘇氨酸鋅組和硫酸鋅組孕鼠都有一定程度的精神萎靡，食量下降，毛發(fā)凌亂等，玉米油組少量的孕鼠出現(xiàn)了一定程度的腹瀉，而空白組則精神狀況良好，沒有明顯的異常癥狀。如表1所示，蘇氨酸鋅組、硫酸鋅組及玉米油組和空白組的孕鼠初始體質(zhì)量比較，沒有顯著性差異（P＞0.05）。實驗結(jié)束后，蘇氨酸鋅組、硫酸鋅組孕鼠體質(zhì)量增加量和玉米油組及空白組比較，差異顯著（P＜0.05），玉米油組孕鼠和空白組體質(zhì)量增加量比較，沒有顯著性差異（P＞0.05）。

表1 孕鼠孕期體質(zhì)量（x±s，n＝6）Table 1 Body weight of pregnant rats (x±s，n＝6)

2.2 對孕鼠及胎鼠發(fā)育的影響

表2 孕鼠孕期生殖功能指標（x±s，n＝6）Table 2 Reproductive parameters of pregnant rats (x±s，n＝6)

如表2所示，玉米油組與空白組比較，孕鼠的子宮質(zhì)量、著床數(shù)及活胎數(shù)差異顯著（P＜0.05）；與玉米油組相比，蘇氨酸鋅組和硫酸鋅組的著床數(shù)，無顯著性差異（P＞0.05），但玉米油組和空白組相比，差異顯著（P＜0.05）；與空白組比較，蘇氨酸鋅組的著床數(shù)差異顯著（P＜0.05），但蘇氨酸鋅組的子宮質(zhì)量和活胎數(shù)與空白組比較，則無顯著性差異（P＞0.05）；硫酸鋅組與空白組比較，著床數(shù)、活胎數(shù)和子宮質(zhì)量均無顯著性差異（P＞0.05）。蘇氨酸鋅組和硫酸鋅組均出現(xiàn)了吸收胎，但差異無統(tǒng)計學意義，而玉米油組和空白組則正常。

表3 胎鼠生長發(fā)育指標（x±s，n＝6）Table 3 Indexes of fetal development (x±s，n＝6)

如表3所示，玉米油組和空白組比較，孕鼠的胎盤質(zhì)量、胎鼠體質(zhì)量及身長，無顯著性差異（P＞0.05）；蘇氨酸鋅組和硫酸鋅組的胎盤質(zhì)量、胎鼠體質(zhì)量及身長與玉米油組相比，無顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 對胎鼠內(nèi)臟和骨骼畸形的影響

表4 胎鼠骨骼發(fā)育情況Table 4 Skeleton development in the fetuses

采用徒手切片的方法觀察胎鼠內(nèi)臟，只有硫酸鋅組胎鼠發(fā)現(xiàn)有胃腸道松弛，肝、肺充血等狀態(tài)，其他組均未檢查出內(nèi)臟畸形或變異。如表4所示，玉米油組出現(xiàn)了13 例胸骨畸形，其中第2、5、6胸骨缺失的有6 例，第2、5胸骨缺失的有7 例，與空白組相比，差異顯著（P＜0.05）。蘇氨酸鋅組胎鼠胸骨畸形18 例，其中第2、5、6胸骨缺失5 例，第2、5胸骨缺失12 例，第4胸骨缺失1 例，另有3例胎鼠第13肋骨出現(xiàn)了發(fā)育不全同時還出現(xiàn)了8 個吸收胎，與玉米油組相比，差異顯著（P＜0.05）。硫酸鋅組在實驗過程中有兩只孕鼠死亡，胎鼠胸骨缺失有13 例，其中第2、5、6胸骨缺失3 例，第2、5胸骨缺失2 例，第6胸骨缺失的有1 例，第4胸骨缺失的有3 例，同時胸骨數(shù)量少于3 的有4 例，還有2 例第13根肋骨發(fā)育不全，與玉米油組相比，差異顯著（P＜0.05，胎鼠總數(shù)不同）。空白組出現(xiàn)了6 例胸骨缺失，主要是第5、6 胸骨缺失。各組均未見頭骨、尾骨、椎骨等畸形。

3 討 論

由于蘇氨酸鋅的溶解度比較小，實驗采用玉米油作溶劑，配制成乳濁液進行灌胃，溶劑對照組（玉米油組）給予相同劑量的玉米油，發(fā)現(xiàn)玉米油組出現(xiàn)了13 例胸骨畸形（畸形率27.7%），與空白組6 例胸骨畸形（畸形率20.0%）比較，差異顯著（P＜0.05）。實驗結(jié)果表明用玉米油作溶劑時，會對大鼠胚胎-胎仔發(fā)育毒性實驗產(chǎn)生干擾作用，這與文獻報道一致[19]。蔡鳴等[20]也研究發(fā)現(xiàn)，將玉米油按5 mL/kg于SD大鼠妊娠第6～15天連續(xù)灌胃給藥，發(fā)現(xiàn)玉米油組出現(xiàn)攝食量下降，吸收胎數(shù)明顯增加，且玉米油組出現(xiàn)了34 例胸骨畸形，與空白組比，差異顯著（P＜0.05）。上述結(jié)果表明玉米油組胎鼠胸骨畸形數(shù)顯著多于空白組，故推測玉米油對實驗結(jié)果有疊加的作用，在后期的實驗當中建議更改溶劑，使實驗結(jié)果更具有參考性。

實驗過程中發(fā)現(xiàn)，蘇氨酸鋅組從第6天灌胃開始，孕鼠活動受抑制，自由活動減少，毛發(fā)凌亂，同時攝食量也明顯降低，大約4～5 d后會慢慢恢復正常。硫酸鋅組從第6天開始灌胃后也出現(xiàn)了孕鼠活動減少，毛發(fā)凌亂，同時伴有一定程度的腹瀉，實驗過程中灌胃的劑量和文獻報道中的半致死劑量很相近[21]，出現(xiàn)了兩只孕鼠死亡。而攝食量的減少，直接影響到孕鼠的體質(zhì)量，兩組相比較，孕鼠體質(zhì)量的增加沒有顯著性差異（P＞0.05），孕鼠的著床數(shù)、活胎數(shù)、子宮質(zhì)量、胎鼠體質(zhì)量和胎盤質(zhì)量等也無顯著性差異（P＞0.05）。在胎鼠骨骼方面，硫酸鋅組（畸形率為62.5%）的骨骼畸形顯著多于蘇氨酸鋅組（畸形率46.7%），可見蘇氨酸鋅與硫酸鋅相比毒性較低，相對安全。另外實驗中還發(fā)現(xiàn)硫酸鋅組和玉米油組都出現(xiàn)了不同程度的腹瀉，而蘇氨酸鋅組只有很輕微的腹瀉，由此推測蘇氨酸鋅可能在一定程度上能降低SD大鼠的腹瀉率。

骨骼的發(fā)育存在廣泛的可塑性，一般情況下，自然發(fā)生率相對高的群體所發(fā)生的變異趨勢通常是可逆的，對動物不產(chǎn)生或產(chǎn)生很小的有害性后果[22]。綜合以上實驗結(jié)果推測，蘇氨酸鋅對健康育齡的SD大鼠胚胎-胎仔發(fā)育毒性相對硫酸鋅而言較小，比較安全。后續(xù)實驗還將探討更換溶劑后高劑量鋅源對胎鼠胸骨發(fā)育的影響及其行為致畸學研究。

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Comparison of Teratogenic Effects of Different Zinc Sources at High Dose on Fetuses of Sprague-Dawley (SD) Rats

FENG Jian-ping, WANG Guang-ran, HU Xiao-bo, JIANG Wen-wen, XIE Ming-yong*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Objective: To observe the toxic effects of zinc threoninate chelate (Thr-Zn) and zinc sulfate on the embryo-fetal development in Sprague-Dawley (SD) rats on days 6 to 15 of pregnancy when they were diluted with corn oil. Methods: The pregnant rats were administered daily with Thr-Zn at a dose of 1 200 mg/(kg·d) bw or the same zinc dose from zinc sulfate (575 mg/(kg·d)) by gavage during days 6 to 15 of pregnancy and the basic living conditions were observed. Body weights were measured on days 0, 4, 8, 12, 16 and 20 of pregnancy, respectively. On day 20, the pregnant rats were sacrificed and their uterus were collected and weighed. The numbers of corpora lutea, implantations, absorbed fetuses, dead fetuses and live fetuses were examined. Fifty percent of fetuses were examined for visceral alterations and the remaining half were examined for skeletal abnormalities. Results: For both the Thr-Zn and zinc sulfate groups on the 7th day, the food intake was significantly decreased (P ＜ 0.05), and the weight gain also was significantly reduced (P ＜ 0.05). The Thr-Zn group had 18 cases of sternal missing and compared with the corn oil group, the difference was statistically significant (P ＜ 0.05). The zinc sulfate group had 13 cases of sternal missing and two pregnant rats died; compared with the corn oil group, the difference was similarly statistically significant (P ＜ 0.05). Conclusions: High-dose administration of the two zinc sources has certain reproductive toxicity on pregnant SD rats, but Thr-Zn is relatively safe.

zinc threoninate chelate; zinc sulfate; skeletal malformations; developmental toxicity

TS201.6

A

1002-6630（2014）17-0241-04

10.7506/spkx1002-6630-201417046

2013-10-25

江西省自然科學基金項目（20132BAB204002）；江西省重大科技創(chuàng)新研究項目（20124ACF00400）；江西省教育廳2011年度產(chǎn)學研合作項目（GJJ11002）

馮建萍（1987—），女，碩士研究生，研究方向為營養(yǎng)保健與功能食品。E-mail：415184945@qq.com

*通信作者：謝明勇（1957—），男，教授，博士，研究方向為食品營養(yǎng)學、食品安全、功能保健食品。E-mail：myxie@ncu.edu.cn