精子發生和運動相關蛋白的研究新進展

汪智瓊李紅飛張 玲劉晙玭平光倫張志兵,.武漢科技大學醫學院公共衛生學院（武漢 430065）; 2. Departments of Obstetrics and Gynecology and Biochemistry, Virginia Commonwealth University, Richmond, VA 23298

·綜 述·

精子發生和運動相關蛋白的研究新進展

汪智瓊1李紅飛1張 玲1劉晙玭1平光倫1張志兵1,2*1.武漢科技大學醫學院公共衛生學院（武漢 430065）; 2. Departments of Obstetrics and Gynecology and Biochemistry, Virginia Commonwealth University, Richmond, VA 23298

近年來男性不育癥的發病率有不斷上升趨勢，在男性不育的各種原因中，精子發生障礙是一個重要因素，其中遺傳因素缺陷導致的精子發生障礙是一個重要機制[1]。男性精子發生是一個復雜的細胞分化過程，受到諸多有序表達基因的調控，其中任何一個基因發生缺失、突變或表達異常都可能引起精子生成障礙，導致男性不育[2]。近年來隨著小鼠基因敲除技術的廣泛運用，越來越多調節精子發生的基因被發現[3]，據報道目前有超過2300個基因參與[4]。其中有些蛋白在精子發生中發揮重要的功能，如調控哺乳動物精子發生、精子運動、精子獲能、頂體反應和精卵融合等生物過程，另外有些精子抗原可能與受精和胚胎的早期發育有密切關系 。本文基于目前國內外的研究報道，綜合論述了幾種重要的蛋白調節精子鞭毛運動的機制。

一、精子相關抗原6（Sperm- associated antigen 6，SPAG6）

SPAG6基因表達蛋白是精子鞭毛支架蛋白的一種，對維持精子鞭毛結構完整和精子鞭毛活動有重要作用。SPAG6最初是用不育男性患者的高滴度抗體血清篩選睪丸基因表達文庫而克隆出來的，SPAG6基因缺失或沉默時,動物表現為精子活力損傷、精子畸形和雄性不育[5]。目前對人類和鼠類的SPAG6基因的研究發現，該基因均在睪丸中高度表達，編碼1.8kb和2.8kb mRNA[6]。此外，具有運動纖毛的組織，如肺、腦室膜中SPAG6也有少量表達，另有報道北京油雞SPAG6基因位于2號染色體上，共有l0個外顯子和9個內含子，基因全長為32.6 kb,該基因突變影響其精液品質和性發育相關性狀[7]。體外轉染實驗中，通過免疫熒光實驗在激光共聚焦掃描顯微鏡下發現，該蛋白在真核細胞中定位于微管。在運動纖毛內，SPAG6定位于調節纖毛運動的中心軸突上，并且決定其他蛋白（如SPAG16，SPAG17）在中心軸突的定位[8,9]。哺乳動物SPAG6的功能非常保守，在低等生物，如雙鞭毛藻類中是衣藻PF16（paralysed flagella 16）的同源體，該同源蛋白PF16也位于鞭毛中央軸突的中心管內參與調節鞭毛的運動[10]。目前，SPAG6基因敲除小鼠模型已經建立，SPAG6缺失小鼠由于運動纖毛功能障礙而表現出雄性不育。有研究顯示，SPAG6該蛋白在微管及中心體（一種微管組織中心）中表達，近一半SPAG6缺失小鼠生長較正常小鼠顯著減慢，提示SPAG6可能和細胞生長有關。最近研究表明SPAG6作為新型癌胚抗原，在肺癌等腫瘤組織中表達顯著增加，表明該基因跟腫瘤形成有關[11]。因此，SPAG6的功能遠遠超過了維持精子鞭毛結構完整和精子鞭毛活動的功能。

二、精子相關抗原16（Sperm-associated antigen 16，SPAG16）

哺乳動物SPAG16是衣藻PF20（paralysed flagella 20）的同源體[12]，對維持和執行“9+2”結構有重要的作用。“9+2”軸絲是在運動纖毛和鞭毛內發現的，是由9個雙峰微管通過能夠產生協同力的肌動復合物-肌動蛋白臂的機動作用連接到一對中央微管，是一種細胞骨架結構[13]。衣藻PF20基因只翻譯一個蛋白，該蛋白位于衣藻鞭毛中央軸突的中心管內以調節鞭毛運動，當PF20的表達缺失時，鞭毛運動力喪失。同衣藻PF20不同，小鼠SPAG16基因翻譯兩個蛋白， 全長71 kDa 的SPAG16L及35 kDa 的SPAG16S[14]。SPAG16L蛋白被發現存在于所有鼠類的運動纖毛和鞭毛中，定位于運動纖毛中心管，同衣藻PF20一樣調節鞭毛運動[15]。SPAG16S同SPAG16L的C 端序列完全相同，表現為SPAG16L的C 端蛋白，該蛋白僅在雄性精子細胞中表達，顯著性表達于核的特殊區域，有7個WD重復序列以介導蛋白相互作用。與SPAG16L不同，SPAG16S除在生精細胞胞漿中表達外，還在細胞核中表達，該蛋白參與調節精子發生[16]。在純合子小鼠中敲除SPAG16L基因，僅僅表現為雄性不育，但精子發生過程無異常表現。但如果同時敲除SPAG16L和SPAG16S的表達，可見在精子發生過程中出現了嚴重的缺失。將SPAG16S轉染到鼠精子細胞和BEAS-2B（人類支氣管分泌壁細胞）中，可增加SPAG16L的表達。以上實驗證實SPAG16S在精子細胞的基因表達系統中起了非常重要的作用。

為了進一步檢測SPAG16L的功能，有學者建立SPAG16L缺失的基因敲除小鼠模型，結果發現轉基因小鼠仍可表達SPAG16S，基因突變的動物發育正常，未出現纖毛缺失相關癥狀如腦水腫，腦側偏癱缺失，鼻竇炎，支氣管炎或多囊腎等。然而，雄性不育個體的精子在數量上比正常精子數低，精子的活動力明顯缺失（盡管在結構上的異常沒有得到證實）。此外，會出現少量生精小管中的生精細胞退化，因此可得出以下結論：SPAG16可通過影響精子數量及活動力，對精子鞭毛的功能起重要的作用。

有文獻進一步證實[17]，缺乏SPAG16L基因的正常純合小鼠，鞭毛回應鈣的能力下降，直接影響了鞭毛接受微管滑動動力蛋白的作用，使精子鞭毛發生彎曲，進而影響了精子的運動力。綜上所述可見，SPAG16L是維持正常精子運動力和男性生育能力必不可少的基因。

三、有絲分裂表達基因1（ meiosis expressed gene 1，MEIG1）

前面已述SPAG16基因是精子形成的重要調節因子。SPAG16S是SPAG16基因的一個亞型，分子量為35kDa，首先被發現在精子發生中扮演著重要角色，酵母雙雜交實驗表明，其與減數分裂表達基因1（MEIG1）可發生蛋白間的相互作用。有文獻報道[18]，當MEIG1基因缺失后，突變雄性小鼠在減數分裂過程中未見明顯異常，但在精子發生階段的延長和濃縮階段出現明顯缺陷。在MEIG1基因缺失小鼠中，通過透射電子顯微鏡觀察顯示，一種叫精子領的結構是精子頭部和鞭毛形成必不可少的微管細胞器。MEIG1基因和Parkin基因聯合調節精子，MEIG1基因缺失小鼠同時在睪丸組織中出現PACRG蛋白表達減少。MEIG1基因在精子軸絲/鞭毛的裝配以及PACRG缺失基因小鼠模型的生殖表型中發揮著重要作用。MEIG1/PACRG在精子領（manchette）結構功能和精子控制方面的伙伴關系提供了關鍵角色[19]。

MEIG1的功能仍然不明，之前的研究顯示MEIG1與SPAG16S相關聯，SPAG16S蛋白是一種精子發生必不可少的核蛋白。最近的研究還表明，MEIG1可能是精子發生和纖毛功能形成必不可少的。MEIG1的表達在熱休克轉錄因子2（Hsf2）突變小鼠體內大為降低，這可能導致該突變小鼠生精障礙和生育能力下降[20]。生物信息學分析顯示，MEIG1在鞭毛細胞豐富的組織中表達最多，如睪丸、肺、嗅感覺神經元等，因此推斷MEIG1對鞭毛功能形成有很重要的作用[21]。

為了研究MEIG1基因潛在的功能，有學者建立了MEIG1的條件基因敲除小鼠模型，并通過與CMVCre轉基因小鼠交配，使得MEIG1基因在小鼠體內完全刪除。基因敲除小鼠的研究表明可獲得純合子的小鼠，但雄性小鼠是不育的，僅能產生少數形態異常的精子，精子發生在延伸和濃縮階段大幅減值。這些研究表明，MEIG1是精子形成調控的關鍵蛋白。以前的研究認為，MEIG1在減數分裂中可能發揮著作用。但最新的實驗進一步揭示MEIG1非減數分裂所必需的，但對于精子形成是必須的。

四、S-SOX5（SRY-related High Mobility Group Transcription Factor）

SOX5來自成人睪丸的cDNA文庫，是被發現的SOX（Sry-type HMG box）基因群的新成員，SOX基因群是人類Y染色體性別決定基因中的一類基因，該基因是作用于睪丸而非卵巢組織[22]。SOX基因分為10組，由A-J，它們分別調節不同組織的發育過程。SOX5是SOXD中的成員，含有僅在成人睪丸高表達2kb的S-SOX5和在其他組織中表達6kb的L-SOX5，S-SOX5編碼48kDa的蛋白缺乏N-端，分子量是L-SOX5編碼的蛋白的一半[23]。有文獻報道[24]，SOX5的過度表達與前列腺癌的發生有聯系。此外，當SOX5在12p12.1處單劑量不足，表現出語言發育遲緩，行為能力問題和輕微的變形特征[25]。最先在鼠類中被發現的是S-SOX5，高度同源于SOX5，一直被命名為SOX5出現于許多文獻中，然而，近期證實人類和鼠類都被發現有L-SOX5的存在，但是大多數作者將這作為SOX5同種型，L-SOX5在軟骨細胞與條紋肌肉細胞中高度表達，與SOX6高度同源[26]，提示可能在人類軟骨和肌肉發展中起作用，有文獻報道[27]，L-SOX5和SOX6，SOX9共同在人類間質干細胞的介導下參與軟骨的形成，調節肌細胞的形成。Kiselak等的文章指出[28]，S-SOX5是調節精子相關抗原SPAG6的一個重要轉錄因子，之前的研究已經表明，SPAG6對維持精子鞭毛結構完整和精子鞭毛活動有重要作用，直接影響了精子的發生和運動。經過一系列分子生物學實驗后發現，當S-SOX5在BEAS-2B細胞中過度表達時，SPAG6的基因表達就向上調節，當S-SOX5用RNA干擾，抑制其表達時，SPAG6的基因表達就向下調節。由此可見，S-SOX5是調控SPAG6的一個重要因子，在調節運動鞭毛的形成和維持其功能扮演著重要的角色。S-SOX5的表達直接影響著SPAG6的表達，也就間接地影響了精子的發生和運動。

五、睪丸特定激酶（TSSK2）

SPAG16L編碼的蛋白對正常精子的活力和雄性生殖力有著重要的作用，SPAG16L包含許多潛在的磷酸化位點，并且該蛋白已被證實是在體內進行磷酸化[29]。酵母雙雜交實驗發現了睪丸特定激酶TSSK2[30]，可能是能與SPAG16L發生反應的重要蛋白。TSSK2和SPAG16L的相互作用是通過免疫共沉淀實驗得到進一步證實：這兩種蛋白都取自睪丸和一些能表達該兩種蛋白的細胞溶解物，通過共聚焦顯微鏡顯示，它們共同表達并定位于CHO細胞中，在SPAG16L的C-端發生相互作用，而SPAG16L的N-端包含一個卷曲螺旋結構，不能和TSSK2相互作用。在體外實驗中，SPAG16L可被TSSK2進行磷酸化作用。在大多數沒有SPAG16L的老鼠睪丸中，TSSK2表現出缺失和顯著性降低。實驗結論表明，SPAG16L是TSSK2的酶作用底物。由此可見，TSSK2直接影響了SPAG16L發生磷酸化，間接影響了精子的發生和運動。

Xu等的研究表明[31]，在鞭毛形成過程中，減數分裂后TSSK2集中定位于精細胞的中心體中，除了定位于中心體中，TSSK2還定位于鼠類附睪內精子的尾部和頂體部，定位于人類精子的赤道段，頸部和中段部。TSSK2/TSKS是第一對被發現其定位于精細胞的中心粒和精細胞中的激酶/底物。研究結論是，當TSSK2/TSKS單倍劑量不足，將導致雄性不育，由此可見，在精子形成過程中，特別是鞭毛形成的階段，TSSK2扮演著不可或缺的作用。

精子的生成機制極其復雜，參與調節精子發生的基因也很多，其調節通路繁多，而且各個蛋白相互作用，存在交叉點，選取主要的通路或是關鍵交叉點進行研究，研究重要蛋白相互作用（如SPAG6與S-SOX5，Meig1與Parkin，SPAG16L與TSSK2等）是我們今后研究的重點，下一步我們課題組準備從各通路相互作用入手深入研究精子生成缺陷機制，為治療精子生成障礙等相關疾病提供新思路。

致謝：本課題受國家自然科學基金（81172462）、（81300536）、（81302401）及湖北省自然科學基金（2012FFB04904）、（2013CFB331）資助

不育, 男性; 精子相關蛋白; 精子發生

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（2013-11-05收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.04.021

R 698.2