基因突變檢測PCR-SSCP實驗條件優化研究

張美杰，李軍林，楊 星，高曉彩，2

(1．西北大學生命科學學院/人口與健康研究所，陜西西安 710069;2．西北大學公共管理學院/應用心理學研究所，陜西西安 710127)

基因突變與許多疾病的發生密切相關，有時僅有1個堿基的改變就會造成機體患病甚至死亡，因此搜尋基因突變成為許多疾病研究的切入點。聚合酶鏈反應－單鏈構象多態性(Polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP)是 1989年 Orita等人提出的［1］，由于SSCP分析可以檢測各種點突變，短核苷酸序列的插入或缺失，所以該方法在篩選基因突變時被廣泛采用。雖然PCR-SSCP技術被用于基因突變篩選領域，并且正在發揮著巨大的作用，但是不同研究小組關于PCR產物的變性方法、是否在膠中加甘油以及凝膠中丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的比例等細節的操作都存在很大的差異，不同的核酸序列可能需要不同的凝膠條件［2］，此外該方法還受其他多個因素的影響，所以，PCRSSCP技術的條件不易獲得［3］，因此，在實驗過程中需要不斷的摸索［4］。

為了解決上述PCR-SSCP技術問題，本研究以我們實驗室在使用這一方法進行秦巴山區精神發育遲滯患者(Mental Rrtardation，MR)相關基因突變檢測的實踐經驗為基礎［5－6］，擬利用人類GABBR2基因天然存在的rs282129位點(該位點是一個T/C二態位點，T到C的顛換可導致編碼蛋白Met轉變為Thr［7］)為基因突變位點，并以人血液DNA為實驗材料，依次采用不同的變性劑、甘油、交聯度、TBE緩沖液和電泳時間等來摸索PCR-SSCP技術。希望能找到最佳的PCR-SSCP條件，讓該技術操作變得更為簡便，更適合一般實驗室的應用。進而使PCR-SSCP技術為治療人類疾病提供更好的應用效果。

1 材料與方法

1．1 實驗材料

在西安市某高校隨機選取10名18～22歲漢族健康大學新生為研究對象。本研究獲國家人類基因組中心倫理委員會批準，所有被試者均自愿參與并已簽署知情同意書。采集參加者的口腔黏膜細胞樣品，并對個人信息嚴格保密。

1．2 主要試劑

口腔拭子基因組DNA提取試劑盒購于北京天根生化科技有限公司;2×Taq PCR Mix購自西安潤德生物技術有限公司;引物由上海生物工程技術服務有限公司合成。

1.3 實驗方法

1.3.1 DNA的提取 按照口腔拭子基因組DNA提取試劑盒操作說明提取全基因組DNA，置于－20℃冰箱中保存備用。

1.3.2 引物設計 NCBI上查找GABRR2基因rs282129位點及其上下游序列，利用Primer 5軟件設計引物，并在NCBI上使用Primer-Blast對引物特異性進行比較。引物序列如表1所示，由上海生物工程技術服務有限公司合成。

表1 GABRR2基因rs282129位點的引物序列以及其他信息Tab．1 The primers’sequences of rs282129 in GABRR2 gene and other information

1.3.3 PCR擴增 PCR反應體系:總體積10 μL，2 ×Taq PCR Mix 5 μL，25 μmol/L 引物 0.4 μL，DNA 模板 0.4 μL，加 ddH2O 補足 10μL。PCR反應條件:95℃預變性10 min;94℃ 30 s，58.5℃ 30 s，72℃ 45 s，共33個循環;72℃ 10 min，4℃保存。

1.3.4 PCR產物檢測 PCR產物用2%瓊脂糖凝膠(含Goldview染料)檢測，用Bio-Rad凝膠成像系統檢測擴增效果，并根據Maker條帶判斷擴增產物是否為目標片段。

1.3.5 SSCP分析 取 PCR產物2μL，與8μL變性劑和2μL 6×Loading buffer混合，98℃變性10 min，立即轉置冰上冷卻30 min，加入非變性聚丙烯酰胺凝膠，4℃條件下電泳后銀染顯色，判定帶型。

1.3.6 PCR-SSCP條件摸索 凝膠濃度的選擇由PCR擴增片段大小而定，該實驗擴增的DNA片段在300～400 bp之間，根據前人經驗選擇14%的非變性聚丙烯酰胺凝膠。先選擇3種變性劑(堿性、中性、低離子濃度變性劑)進行優化，選出適合的變性劑后依次對加不加甘油、交聯度(丙烯酰胺與甲叉丙烯酰胺的質量比為29∶1或49∶1)、電泳緩沖液(0.5×TBE或1×TBE)和電泳時間(3 h 300 V+14 h 180 V或12 h 300 V)等因素進行摸索，最后確定出最優SSCP條件。具體實驗流程見表2所示。

表2 PCR-SSCP技術的摸索流程Tab．2 Fumble process of the PCR-SSCP technique

2 結果與分析

2.1 PCR擴增產物

用以上引物對rs282129位點進行PCR擴增，得到322 bp DNA產物，沒有引物二聚體和非特異性擴增等雜帶，宜用于SSCP檢測(見圖1所示)。

M為DL2000 DNA Marker;1－5為不同樣品的PCR產物圖1 rs282129位點的PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig．1 Agarose gel electrophoresis figure of rs282129’s PCR product

2.2 SSCP技術的摸索

rs282129位點的PCR擴增產物依次按照表2中不同的變性劑、甘油、交聯度、電泳緩沖液和電泳時間等因素進行SSCP條件的優化。優化結果如下:

2.2.1 變性劑 在堿性、中性、低離子濃度變性劑的摸索過程中發現，堿性和中性變性劑條帶的分辨率比低離子變性劑帶型分辨率高，而且堿性變性劑變性的DNA量要比中性的多。因此選取堿性變性劑對后續條件進行摸索(見圖2A－C所示)。

2.2．2 甘油對凝膠的影響 甘油具有保濕和弱變性劑的作用，對單鏈DNA在凝膠中的泳動速度及提高條帶的分辨率可能產生影響。結合文獻．［8］，設定甘油的體積分數為5%，以空白作對照，比較條帶的分離效果。

本實驗中甘油濃度對單鏈的遷移速度影響大。在凝膠中加入5%的甘油后，單鏈泳動速度較一致，單鏈緊密排列在一起，不易判型(見圖2D所示);而凝膠中不加甘油時，DNA單鏈泳動速度差異大，單鏈條帶相距遠，易判型(見圖2E所示)。

2.2.3 交聯度 當交聯度為29∶1與49∶1的SSCP圖譜相比時，發現交聯度為29∶1的條帶清晰，分離效果好、分辨率高，表明高交聯度有可能會抑制某些SSCP條帶的分離(見圖2E、圖2F所示)。

2.2.4 TBE電泳緩沖液 實驗證明，1×TBE電泳緩沖液產生的條帶模糊，分辨率低(見圖2G所示)。0.5×TBE電泳緩沖液條帶清晰，分辨率高(見圖2F所示)。

2.2.5 電泳時間 300 V 12 h的長時間高壓電泳條帶模糊，分辨率低(見圖2H所示)。而4 h 300 V后14 h 180 V的長時間低電壓條帶清楚，分辨率高(見圖2F所示)。

圖2 PCR-SSCP的摸索結果Fig．2 Grope result of PCR-SSCP

3 討論

3.1 變性劑對SSCP的影響

為了提高DNA變性的效果，往往需要添加化學變性劑。Maruya等人［9］認為用低離子濃度蔗糖變性劑時，可使PCR產物變性更充分、徹底，單鏈更清晰。本實驗與Maraya等人的結果部分一致，雖然低離子變性劑使雙鏈變性量增多，可是條帶遷移率變慢。這樣就嚴重影響了帶型的分辨率，因此認為低離子濃度蔗糖變性劑不適合SSCP分析。并且本實驗發現堿性變性劑比中性變性劑條件下的條帶更清楚，可能是堿性條件下DNA片段單鏈更易形成穩定的空間構象。

3.2 交聯度對SSCP圖譜的影響

凝膠交聯度對單鏈DNA的構象影響較大。如果比例差異大，常會使單鏈DNA在凝膠中形成穩定構象或不穩定的亞構象狀態［10］。有人認為49∶1交聯度的電泳速度較快，條帶分離效果較好，表明高交聯度有可能會促進某些SSCP條帶的分離［11］。但本研究發現，29∶1 與 49∶1 交聯度最明顯差別是前者分離物的帶型清晰，條帶分辨率高，表明高交聯度有可能會抑制某些SSCP條帶的分離。這說明交聯度的選擇可能要根據不同的基因片段來調整，不能一概而論。

3．3 甘油對SSCP圖譜的影響

甘油是一種弱變性劑，可與硼酸離子發生反應生成酸性復合物而降低緩沖液的pH值。甘油對SSCP條帶泳動的影響較為復雜，凝膠中是否添加甘油對不同基因片段的PCR-SSCP分析有不同的效果。如有文獻報道，在非變性的聚丙烯酰胺中加入甘油，可增加 SSCP分析中的單鏈DNA條帶的清晰度進而提高SSCP檢測的靈敏度［12－13］，還有人發現在凝膠中添加甘油后單鏈DNA泳動差異縮小，條帶難以分辨，降低了SSCP分析的靈敏度［14－15］。本實驗研究發現甘油對單鏈的遷移速度影響較大，無甘油時條帶清晰，相距較遠，易分辨，而加入甘油后，單鏈排列緊密，多態性較差，很有可能是甘油通過改變分析片段的單鏈DNA亞穩定的構象來實現的。

3.4 TBE

電泳緩沖液的離子強度是通過改變單鏈DNA分子的三級結構，進而通過非變性聚丙烯酰胺凝膠表現出差異的重要因素。Nakamura等人發現與0.5×TBE相比，1×TBE對300 bp左右的DNA片段分型明顯較好，認為高離子強度可提高突變檢測率［16］。但是，魏太云等［11］和余桂紅等［17］則認為0.5×TBE的電泳緩沖液有利于SSCP的分析。本研究證實同等條件下低濃度的電泳緩沖液有利于提高PCR-SSCP的分型圖譜。所以，在PCR-SSCP分析過程中應根據實驗時的具體情況進行調整。

3.5 電壓

我們發現一段時間高壓后改為長時間的低壓比長時間高壓的分型效果好。開始的高壓有助于DNA快速浸入膠中，并且還可使它們都處于同一個水平線上，隨后的長時間低電壓可使由于不同構象的DNA在膠中有不同的泳動速率而把它們分開。長時間的高壓電泳有可能會產生熱量，使DNA的單鏈狀態復性成原來的雙鏈狀態，導致膠中單鏈的亮度大大下降;而且熱量的產生還會影響單鏈的空間構象，從而使單鏈跑出的帶型處于模糊的狀態［18］。

本實驗通過PCR-SSCP技術在篩選基因突變過程中進行摸索，結果表明:用堿性變性劑對PCR產物進行變性，凝膠濃度為14%、丙烯酰胺與甲叉丙烯酰胺的交聯度為29∶1、無甘油、0.5×TBE的緩沖液進行4 h 300 V后14 h 180 V電泳可得到較理想的圖譜。總之，PCR-SSCP是一項精確度高、重復性好、操作簡單和低成本的技術［19］。但是，該方法受到多種因素的影響，在操作過程中如果能嚴格控制實驗條件，并且與其他的先進分析方法相結合，該技術有可能會成為一種核酸分析的主流方法并會拓寬到更廣泛的應用領域。

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