刺五加過氧化氫酶基因的克隆與表達分析

邢朝斌，劉 巖，修樂山，龍月紅，吳 鵬

(河北聯(lián)合大學 生命科學學院，河北 唐山 063000)

植物細胞正常代謝過程中，氧分子作為重要的電子受體，在傳遞電子時，通常還伴隨著部分電子逃逸出氧化還原系統(tǒng)，產生氧化能力極強、具有毒害作用的H2O2[1]。同時，植物在遭受病原菌脅迫及逆境脅迫時也可產生大量H2O2[2]。H2O2的過量積累可導致膜脂過氧化，抑制卡爾文循環(huán)的關鍵酶，從而對細胞造成較大的傷害，另外H2O2還可以直接作為氧化劑對植物組織產生毒害作用[3]。過氧化氫酶(Catalase，CAT)廣泛存在于動植物中，對于H2O2具有較高親和力，可有效地清除線粒體電子傳遞、脂肪酸氧化等過程中產生的H2O2，參與植物的多種脅迫反應，如抗病、抗旱、耐鹽等，并與植物老化也有一定的關系[3-4]。因此，植物CAT對維持植物氧化還原平衡和抵御脅迫方面具有重要的作用[5]。

刺五加Eleutherococcus senticosus(Rupr.et Maxim)Maxim是我國傳統(tǒng)的珍貴藥用植物，具有多種生理活性及藥理作用[6]。一般認為包括病原菌及干旱、低溫等在內的各種脅迫條件對藥用植物次生代謝產物的形成具有重要的影響[7]。因此，克隆參與多種脅迫反應的刺五加CAT基因并分析其表達情況，對揭示其次生代謝產物產量差異形成的分子機理具有重要意義。但目前關于刺五加的研究多集中在直接參與其次生代謝產物生物合成的關鍵酶基因方面[8-10]，尚未見關于刺五加CAT基因的相關報道，致使相關工作難以開展。文中利用cDNA末端快速擴增(Rapid Ampli fi cation of cDNA Ends，RACE)技術克隆到刺五加CAT基因的全長cDNA序列，并分析了其在不同生長發(fā)育時期、不同器官中的表達，旨在為深入研究CAT對刺五加生長及次生代謝的影響提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試刺五加采自黑龍江省雞西市。分別以萌芽期(4月26日)、葉片完全展開期(5月26日)、盛花期(6月26日)、果實快速生長期(7月26日)、果實基本成熟期(8月26日)、葉片衰老期(9月26日)的葉片和8月16日的葉片、葉柄、幼莖和根作為提取RNA的試材。

1.2 試驗方法

1.2.1 刺五加總RNA的提取和CAT基因保守區(qū)的獲得

根據植物總RNA提取試劑盒的說明，分別提取刺五加1～10號樣本的總RNA。利用Oligo(dT)18引物，以2μL的總RNA為模板，按照RevertAidTMFirst strand cDNA synthesis Kit的步驟說明，分別將各樣本的總RNA逆轉錄為cDNA。以逆轉錄獲得的刺五加cDNA為模板，利用簡并上游引物CATS1：5′- GGAAACAA(C/T)TTCCCTGTC -3′和簡并下游引物 CATX1：5′- ACCTC(C/T)TC(A/G)TCCCTGTGC -3′，PCR擴增刺五加CAT基因的保守區(qū)核苷酸序列。反應體系50μL，其中LA Taq酶0.6μL，上下游引物各 1μL，cDNA 3μL，2.5mmol·L-1dNTP 4μL，10×LA Taq Buffer 5μL，補 ddH2O 至 50μL。反應條件為：95℃，5min；95℃，1min；51.5℃，40s；72℃，50s。35個循環(huán)后72℃補充延伸10min。擴增產物經1.5％瓊脂糖凝膠電泳、回收后，克隆入PGM-T質粒載體，轉化大腸桿菌TOP10。將轉化成功的菌株送Invitrogen公司測序。

1.2.2 RACE技術獲取刺五加CAT基因cDNA 的末端序列

根據所獲得的刺五加CATcDNA核苷酸序列，應用Primer premier 5.0設計5′RACE擴增刺五加CAT基因，5′末端序列的特異性引物CAT52：5′-TCTGGGTGGTGGGAGAAGAAGT-3′和CAT51：5′-GTGAGACTTTGGACTGGGTTTA-3′，及3′RACE 擴增刺五加CAT基因3′末端序列的特異性引物CAT32：5′- TGCCCTGCT ATTATCGTTCCTG -3′和 CAT31：5′- CGCTCATC ACAACAATCACCAT -3′。參照羅聰?shù)萚11]的方法，取刺五加總RNA 3μL，逆轉錄合成cDNA第1鏈后，利用5′RACE技術擴增CAT基因cDNA的5′末端序列。參照3′-Full RACE core set Ver.2.0試劑盒說明，進行3′RACE擴增。參照1.2.1中的方法電泳、回收、克隆、測序。

1.2.3 刺五加CAT基因全長的拼接、驗證與生物信息學分析

將獲得的刺五加CAT基因的5′、3′末端序列和保守區(qū)序列導入DNAMAN 6.0軟件，進行拼接，獲得刺五加CAT基因cDNA的全長序列。根據拼接獲得的序列，設計擴增包含CAT基因起始密碼子的上游引物CATQS：5′-CTCATCAAACAATCCGTCTC-3′和 包 含 終 止密碼子的下游引物CATQX：5′-CTCTTTCTCGCA ATCAACAG-3′，PCR擴增CAT基因的 cDNA全長序列，預計擴增1 558 bp。反應條件為：95℃，5min；95℃，1min；55℃，40s；72℃，100s。30個循環(huán)后72℃補充延伸10min。PCR擴增體系與1.2.2中相同。參照文獻[12]中的方法，利用DNAMAN 6.0、PROSITE、ProtParam、PSORT和SOPMA軟件進行生物信息學分析。使用MEGA 5.21軟件中的Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 刺五加CAT基因的表達分析

參照文獻[12]中的方法，利用預計擴增CAT基因長度為168 bp的上游引物CATRTS：5′- CTGCCCTGCTATTATCGTTCC-3′，下 游 引 物CATRTX：5′-AAGCCTTCATGGTGATTGTTGTG-3′，和預計擴增刺五加GAPDH基因長度為134 bp的引物RGS和RGX，進行表達量分析。

2 結果與分析

2.1 刺五加CAT基因的克隆

以刺五加的cDNA為模板，利用簡并引物CATS1和CATX1進行PCR擴增后，測序獲得1條長761 bp的條帶(見圖1)。經NCBI的BLAST比對，確定該序列為刺五加CAT基因cDNA的部分序列。利用CAT52和CAT51引物，5′RACE擴增后，測序獲得CAT基因長633 bp的5′末端cDNA序列(見圖1)。利用CAT32和CAT31引物，3′RACE擴增后，測序獲得CAT基因長551 bp的3′末端cDNA序列(見圖1)。將所獲得的保守區(qū)片段與5′、3′末端cDNA序列進行拼接，發(fā)現(xiàn)該序列包含刺五加CAT基因的完整開放閱讀框(ORF)。利用CATQS和CATQX引物，以刺五加的cDNA為模板，PCR擴增后，測序獲得1條長1 558 bp的條帶(見圖1)，與預期大小相符。且該序列與拼接獲得的序列完全相同。

圖1 刺五加CAT基因的克隆Fig.1 Clone of CAT gene from E.senticosus

2.2 刺五加CAT基因的生物信息學分析

刺五加CAT基因全長1 840 bp(GenBank登錄號：KF498592)，其中5′端非翻譯區(qū)(5′UTR)長 138 bp，3′端非翻譯區(qū)(3′UTR)長 223 bp，終止密碼子為TGA，開放閱讀框(ORF)長1 479 bp，3′末端具有poly A尾，編碼492個氨基酸殘基構成的蛋白質。預測的蛋白質相對分子質量為56.689 1 kD，理論等電點(pI)為7.11。氨基酸序列與人參Panax ginseng、可可Theobroma cacao和棗樹Ziziphus jujuba的同源性分別達到96.5％、96.3％和96.3％。通過NCBI的BLAST比對發(fā)現(xiàn)，刺五加的CAT蛋白與其它物種的CAT具有相似的功能結構域。刺五加CAT的14～492氨基酸殘基處為CAT家族的基本輪廓，54～70(FDRERIPERVVHARGAS)氨基酸殘基處為近CAT活性位點保守序列，344～352(RIFSYADTQ)氨基酸殘基處為近血紅素配體保守序列，484～486(SRL)氨基酸殘基處為典型的PTS1(peroxisomal targeting signal)motif，480～482(QKL)氨基酸殘基處為典型的PTS1-like motif。刺五加CAT蛋白不存在跨膜螺旋，定位于過氧化物酶體。刺五加CAT蛋白的二級結構中含有137個α螺旋，占27.85％；78個延伸鏈，占15.85％；31個β折疊，占6.30％；246個無規(guī)則卷曲，占50.00％。

2.3 刺五加CAT蛋白的分子系統(tǒng)進化分析

利用MEGA 5.21軟件，將GenBank中登載的13個物種的CAT蛋白與刺五加的CAT蛋白進行聚類分析，構建CAT蛋白的系統(tǒng)進化樹(見圖2)。刺五加與同為五加科的人參親緣關系最近，首先聚為一支，可信度99％。之后其它雙子葉植物聚在一起，進而與裸子植物聚為一個大的分支。單子葉植物單獨聚為一個分支后與雙子葉植物和裸子植物聚在一起。這與傳統(tǒng)的分類結果相一致。

圖2 CAT蛋白的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of CAT protein

2.4 刺五加CAT 基因的表達分析

刺五加CAT基因在不同生長發(fā)育時期和器官中的表達量變化如圖3所示。自萌芽開始的整個生長期中，CAT基因均有表達，但表達量差異顯著(P＜0.05)。在整個生長期中，CAT的表達呈現(xiàn)先高后低的變化趨勢。萌芽期、葉片完全展開期、盛花期和果實快速生長期的表達量較高，果實基本成熟期和葉片衰老期的表達量較低。其中盛花期的表達量最高，果實基本成熟期的表達量最低，前者是后者的1.28倍。

刺五加的CAT基因在葉片、葉柄、幼莖和根中均有表達，但表達量具有顯著差異(P＜0.05)(見圖3)。最大表達量出現(xiàn)在葉柄中，葉片和根次之，莖中的表達量最低。最高表達量為最低表達量的1.48倍。

3 結論與討論

本試驗中所克隆的刺五加CAT基因包含完整的ORF，與人參、可可和棗樹等的CAT基因的序列同源性均在90％以上，其編碼蛋白具備CAT超家族的標志性序列特征，說明刺五加的CAT基因的cDNA全長序列被成功克隆。一般認為多數(shù)CAT在被翻譯后，通過識別PTS1進入過氧化物酶體發(fā)揮生物學功能[3]。刺五加CAT蛋白484～486位(SRL)的PTS1 motif與擬南芥、冬棗CAT的PTS1 motif序列相同，且均位于距離CAT蛋白C末端上游的第7～9位氨基酸殘基處，行使增強CAT向過氧化物酶體轉運效率的功能[13]。而480～482位(QKL)的PTS1-like motif，為CAT家族的C端保守序列，在CAT與PTS1受體蛋白Pex5p的相互識別中發(fā)揮著重要的作用[14]。

圖3 刺五加不同生長發(fā)育時期及器官中CAT基因的表達變化Fig.3 Expression variations of CAT gene during different growth and development stages and in different organs of E.senticosus

根據CAT表達的時空特點，可將CAT分為在光合組織中高表達的類型I、在維管組織中高表達的類型II和在生殖組織與生殖時期高表達的類型III[15]。系統(tǒng)進化分析的結果表明，刺五加的CAT與屬于類型III的玉米CAT1、水稻CATB[15]的親緣關系顯著近于其它2種類型。同時表達量的分析結果也表明，刺五加的CAT在不同生長發(fā)育時期均有表達，但盛花期的表達量最高的特點也與同屬類型III的人參CAT相符[16]。因此，初步判定研究所克隆的刺五加CAT屬類型III。

已有的研究表明，CAT的表達受植物的發(fā)育時期、組織和器官類型的顯著影響。刺五加CAT自萌芽后開始至果實快速生長期始終高表達的特點與玉米中同屬類型III的CAT1在幼葉期至授粉后21～30d始終高表達[17]的特點完全相符。而刺五加CAT在葉柄中表達量最高，葉片中相對較低的特點則與人參CAT[16]的表達規(guī)律相同。

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