病毒宏基因組及其在鼠類腸道病毒中的研究進(jìn)展

曹婧

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病毒宏基因組及其在鼠類腸道病毒中的研究進(jìn)展

曹婧

671000 大理學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，Email：275824198@qq.com

當(dāng)傳統(tǒng)的序列測(cè)定方法還在測(cè)定某種單一種類的基因組特征時(shí)，宏基因組學(xué)（Metagenomics）卻能超越種族的界限，通過(guò)單一種來(lái)探索變化多樣的微生物群落。這種方法提供了一個(gè)通過(guò)已知單一樣本來(lái)了解整個(gè)生物群體多樣性的全局觀，完全不受培養(yǎng)物需求的限制[1-5]。通過(guò)不懈的努力，我們發(fā)現(xiàn)在這一領(lǐng)域里病毒群落在生態(tài)系統(tǒng)中就像海洋一樣變化多端[1, 6]。病毒宏基因組可以用于描述現(xiàn)存自然環(huán)境中的病毒菌群[1, 7-13]，也可以描述哺乳動(dòng)物糞便中的病毒[14-17]、細(xì)胞培養(yǎng)中的病毒[18-19]、呼吸道抽出物中的病毒[20]以及血液中的病毒[21-22]。

1 病毒宏基因組學(xué)概述

宏基因組學(xué)是近年來(lái)新興的從基因組角度高通量分析在特定環(huán)境中所有微生物遺傳組成的學(xué)科。病毒宏基因組能夠探知整個(gè)生物圈中大部分的生物群體的基因多樣性，并且能夠消除傳統(tǒng)病毒鑒定方法，例如 PCR 或微數(shù)列的局限性。與傳統(tǒng)的宏基因組得到 DNA 全序列的方法相反，在病毒宏基因組的方法中，最初的病毒核酸提純就墊定了病毒序列是否能測(cè)出的基礎(chǔ)。病毒宏基因組能夠了解病毒群體的構(gòu)建，并且能發(fā)現(xiàn)新的基因和病毒。

2 主要技術(shù)路線

2.1 樣品制備

2.1.1 提取核酸 理論上，任何種類的樣品都可以被宏基因組學(xué)分析，包括海水[7]、血液[21]、馬糞[16]、莖株[17]、海洋沉積物[9]、珊瑚組織[23-24]以及溫泉[25]。如果我們想把病毒的 DNA 或 RNA 隔離出來(lái)單獨(dú)研究，特別是想提取某一有代表性的小片段時(shí)，常常會(huì)有些困難。因?yàn)椴《净蚪M的長(zhǎng)度相對(duì)較短，經(jīng)常會(huì)被細(xì)菌或真核生物的核苷酸干擾。因此移除非病毒核酸是非常必要的[26]。這樣我們就要集中樣本中的病毒顆粒，樣本必須經(jīng)過(guò)混合、過(guò)濾、超速離心三個(gè)步驟。為了保證在病毒制備過(guò)程中不損失病毒，在樣本的混合、過(guò)濾、氯仿處理后，要用 SYBR-金染色法來(lái)檢測(cè)病毒顆粒的剩余量[26]。

2.1.2 DNA 酶處理 DNA 酶消化后通常用氯仿處理法來(lái)移除受污染的 DNA。氯仿使線粒體、細(xì)菌和真核生物的膜破裂，從而釋放無(wú)病毒的 DNA 去進(jìn)行下一步的核酸酶處理[27-28]。但是氯仿處理液可能會(huì)破壞保護(hù)包膜病毒的類脂膜，使它們的 DNA 被 DNA 酶消化[21]。此外，DNA 酶處理并非每次都能完全地消除樣本中的無(wú)病毒 DNA[26]。提取核酸后，DNA 可能需要通過(guò)隨機(jī)引物來(lái)進(jìn)行放大處理[29-30]。用 whole transcriptome amplification（WTA）試劑盒能通過(guò)病毒 RNA 合成 cDNA[31]。

2.1.3 分離病毒 由 Allen 和他的研究伙伴們引進(jìn)的單病毒基因組可以在測(cè)序前有選擇地隔離病毒[32]。Brussaard 等[33]最先提出單病毒基因組可以通過(guò)流式細(xì)胞儀將病毒分類。不同大小的 DNA 被瓊脂糖膠固定住，然后用多重置換擴(kuò)增法（multiple displacement amplification）來(lái)擴(kuò)增。在流式細(xì)胞術(shù)和多重置換擴(kuò)增法中，也可以增加一個(gè)單病毒基因組的逆轉(zhuǎn)錄步驟。

2.2 高通量測(cè)序

早先的宏基因組測(cè)序法都與鳥槍法文庫(kù)有關(guān)，并且通過(guò) Sanger 酶的雙脫氧測(cè)序法來(lái)獲得整個(gè) DNA 內(nèi)容物的直接序列。這種方法可以探索海洋環(huán)境中的新噬菌體[34]。1977 年首次記載的 Sanger 技術(shù)是測(cè)序的標(biāo)準(zhǔn)方法[35]。新一代測(cè)序的發(fā)展提供了兼具速度、自動(dòng)化、高通量的測(cè)序平臺(tái)，Sanger 技術(shù)只能從一百個(gè)因子中選取一個(gè)來(lái)測(cè)序，而新技術(shù)卻可以從百萬(wàn)因子中選取一個(gè)。

新一代的測(cè)序平臺(tái)如 Illumina/Solexa 測(cè)序技術(shù)和羅氏 454 測(cè)序已經(jīng)更多地應(yīng)用到病毒宏基因組測(cè)序上。Illumina/Solexa 測(cè)序技術(shù)的基礎(chǔ)是測(cè)序合成的化學(xué)作用，將樣本的 DNA 片段和寡核苷酸連接物連接。連接物在載體中扮演一個(gè)引物的角色，作用是將 DNA 多聚酶和可逆的終止子核苷酸結(jié)合，每一個(gè)都用不同的熒光染料標(biāo)記。一個(gè)有代表性的測(cè)序可以產(chǎn)生 18 G的數(shù)據(jù)，讀出的核苷酸的平均長(zhǎng)度在 75 ~ 100 bp[36]。例如甘薯?xiàng)U狀 DNA 病毒屬（sweet potato badnavirus）和甘薯玉米線條病毒屬（sweet potato mastrevirus）就是通過(guò) Illumina/Solexa 測(cè)序平臺(tái)發(fā)現(xiàn)的[37]。

現(xiàn)在為了發(fā)現(xiàn)和鑒定新病毒，最常使用的就是羅氏公司生產(chǎn)的 454 測(cè)序儀。這種平臺(tái)經(jīng)常用來(lái)鑒定未被記錄過(guò)的真菌病毒，例如紅火蟻病毒 3（solenopsis invicta virus 3）[38]、Merino Walk 病毒和新的沙粒病毒[39-40]。為了測(cè)序，必須把 DNA 變成片段，連接在被生物素酶化的特殊連接子上。DNA/連接子的合成片段連接在一個(gè)鋪滿抗生蛋白鏈菌素的串珠狀固定凹上，這個(gè)固定凹能將 DNA 鎖在一小滴水和PCR 碎片里，然后保存在油乳膠中。第一輪擴(kuò)增中的每一個(gè)片段都是為了制造測(cè)序反應(yīng)的模板。為了能夠測(cè)序，在退火時(shí)將引物與模板的連接子部分合成，然后用 DNA 多聚酶將核苷酸結(jié)合，以便使互補(bǔ)的DNA更容易延伸。某些光感產(chǎn)品可以測(cè)量這一過(guò)程中釋放的焦磷酸鹽的量[41-42]。在DNA多聚酶介導(dǎo)DNA合成的過(guò)程中，羅氏 454 法把焦磷酸鹽的釋放作為核苷酸結(jié)合的結(jié)果。電荷耦合器件（charge-coupled device）相機(jī)可以捕捉光信號(hào)，然后將光信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)[43-44]。454 測(cè)序最合適的范圍：大概可以讀取一百萬(wàn)個(gè)平均長(zhǎng)度在 350 ~ 450 bp 的核苷酸，總量在 0.4 G 左右。

2.3 生物信息學(xué)分析

在對(duì)病毒序列進(jìn)行分類指令時(shí)有一個(gè)內(nèi)部難題：用來(lái)建立系統(tǒng)樹的所有病毒中并沒(méi)有一個(gè)普遍對(duì)應(yīng)的核苷酸成分——某個(gè)因子同時(shí)也能討論病毒是否屬于生命樹[45]。在大多數(shù)的宏基因組研究中，同源性搜索通過(guò)比對(duì)儲(chǔ)存于本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)或是公共數(shù)據(jù)庫(kù)中記錄在案的序列后，總是對(duì)高通量測(cè)序產(chǎn)生的序列有所疑問(wèn)。更巧的是，若比對(duì)未知病毒序列，同源性搜索便會(huì)拒絕 GenBank 中的已知序列。

關(guān)于宏基因組庫(kù)的分析，要求對(duì)于有爭(zhēng)議的病毒片段能夠快速地計(jì)算和正確地分析。為了保證生物信息學(xué)分析的數(shù)據(jù)都是高質(zhì)量的，讀取的數(shù)據(jù)都必須是經(jīng)過(guò)典型處理的。處理的方法就是移除所有背景序列，包括在過(guò)濾、氯仿、DNase I 處理后仍殘留的宿主和細(xì)菌的DNA[46-48]。我們從相同生物體的類似種中得到的每一個(gè)序列都是合成序列，合成序列的讀取需要與嚴(yán)格的參數(shù)組合才能產(chǎn)生毗連序列群。使用一個(gè)嚴(yán)格的匯編參數(shù)是避免序列抗體嵌合的關(guān)鍵。然后將毗連序列群序列用 BLAST100 或 USEARCH101 來(lái)與 GenBank 中無(wú)多余核苷酸的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。如果用一個(gè)只包含病毒序列的數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)記錄這些，將不能鑒別未知的細(xì)菌、古細(xì)菌或者真核生物的序列，并且將導(dǎo)致對(duì)未知片段的過(guò)高評(píng)價(jià)。

由于不同研究會(huì)產(chǎn)生越來(lái)越多的數(shù)據(jù)，需要記錄不同的病毒宏基因組，但是由于缺乏下游數(shù)據(jù)分析的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)則，交叉宏基因數(shù)據(jù)分析法變得越來(lái)越重要[49-50]。具體方法就是要做好病毒宏基因組研究的相關(guān)報(bào)告，包括記錄：①測(cè)序平臺(tái)和版本號(hào)；②在原始數(shù)據(jù)庫(kù)登錄的原始序列數(shù)據(jù)；③關(guān)于生物信息學(xué)分析的數(shù)據(jù)，包括同源性搜索工具和用于生物分類學(xué)分配的數(shù)據(jù)和它們的版本；④已知病毒和以前未知病毒的對(duì)比，清楚地體現(xiàn)這個(gè)新病毒究竟是屬于已經(jīng)收錄的種中的一個(gè)新菌株還是完全不同的病毒；⑤如果需要的話，加上因果性證據(jù)。

3 鼠類腸道病毒宏基因組的研究

人類和鼠類頻繁的交互作用使兩者有著共同的動(dòng)物傳染病。鼠類是眾所周知的天然宿主，它能儲(chǔ)存為數(shù)眾多的動(dòng)物源性病毒，這些病毒可以使人類患上嚴(yán)重的疾病。鼠攜帶病毒種類包括了痘病毒科（）、皰疹病毒科（）、腺病毒科（）、多瘤病毒科（）、細(xì)小病毒科（）、反轉(zhuǎn)錄病毒科（）、嗜肝 DNA 病毒科（）、副黏病毒科（）、沙粒病毒科（）、黃病毒科（）、布尼亞病毒科（）、星狀病毒科（）、微 RNA 病毒科（）和冠狀病毒科（）等 10 多個(gè)病毒科。我們用宏基因組這種無(wú)偏倚的方法去了解鼠類糞便中眾多的病毒。Phan 等[51]最近用宏基因組學(xué)的方法，對(duì)美國(guó)捕獲的 105 只鼠類標(biāo)本進(jìn)行了腸道病毒研究，共獲得 26 846 條病毒序列（> 100 bp），包括圓環(huán)病毒科（）、雙生病毒科（）、矮縮病毒科（）、濃核病毒科（）、細(xì)小病毒科、擬態(tài)病毒科（）、乳頭瘤病毒科（）、星狀病毒科、虹彩病毒科（）、多分體 DNA 病毒科（）、桿狀病毒科（）、雙組分 RNA 病毒科（）、微 RNA 病毒科、雙順?lè)醋硬《究疲ǎ魅拘攒浉〔《荆ǎ⑾俨《究啤⑿菭畈《究疲ǎ⒁疤锎宀《究疲ǎora 病毒、冠狀病毒科等 20 多科的病毒，其中還發(fā)現(xiàn)新的鼠乳頭瘤病毒、圓環(huán)病毒、博卡病毒（Bocavirus）、微小核糖核酸病毒、微 RNA 病毒、星狀病毒、腺病毒和腺聯(lián)病毒等。用宏基因組這種方法可以大大地提升我們對(duì)鼠類中的真核病毒多樣性的認(rèn)識(shí)。結(jié)合宏基因組學(xué)、隨機(jī) PCR 和 454 高通量測(cè)序等技術(shù)，分析不同鼠類種群中腸道病毒群基因組組成、豐度和動(dòng)態(tài)變化，可以豐富我們對(duì)自然環(huán)境中未知病毒的認(rèn)識(shí)，為預(yù)防和控制一些可能發(fā)生的新發(fā)病毒性疾病的暴發(fā)和流行提供科學(xué)的指導(dǎo)。

4 展望

病毒宏基因組是一個(gè)能探索病毒生物學(xué)世界的新工具，并且這一領(lǐng)域的蓬勃發(fā)展對(duì)其他領(lǐng)域也有很多益處。現(xiàn)在科學(xué)家們?cè)谘邪l(fā)可以用來(lái)治療疾病以及用于生物技術(shù)等方面的新病毒酶。病毒宏基因組在監(jiān)測(cè)病毒病原體方面也有著巨大的優(yōu)勢(shì)，這對(duì)公眾健康和食品安全也十分重要。昆蟲可以通過(guò)傳播媒介把目標(biāo)病毒傳給人類和植物，宏基因組在現(xiàn)有的領(lǐng)域可以了解病毒的循環(huán)并且能夠提早發(fā)現(xiàn)、鑒別病毒病原體。此外，從人類糞便中得到的宏基因組數(shù)據(jù)也可作為一種新的指示劑來(lái)鑒別糞便污染的問(wèn)題，對(duì)水的質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)。總而言之，病毒宏基因組提供了科學(xué)的方法去探索廣闊環(huán)境中的病毒，這樣就可以了解病毒的多樣性，了解病毒的進(jìn)化過(guò)程，也能作為一種新的探測(cè)方法應(yīng)用在社會(huì)生活中。

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2014-04-01

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.06.011