藥品細菌內毒素檢查法實驗體會

劉恩思

藥品細菌內毒素檢查法實驗體會

劉恩思

鱟是海邊棲生的一種大型節肢動物, 其多功能血細胞(變形細胞)的溶解物中含有一種可凝性蛋白質, 在極微量內毒素(0.0005 vg/ml)存在時可形成凝膠。鱟試驗法是利用此原理測定血液或其他樣品中的微量內毒素的生物體外檢測技術。自從1964年美國學者發現鱟試驗法以來, 因為其具有快速、簡便、經濟、靈敏度高、重現性好、一次可同時測幾個樣品等優點, 該法正被日益廣泛地應用于檢測食品、水源、藥品、醫療器械、動物體液等不同樣品中的內毒素。在20世紀70年代初期, 我國學者對鱟試驗法開始了研究。1991年, 衛生部部版標準首次收載了細菌內毒素檢查法；1993年,《中國藥典》(1990年版)第二增補本正式收載該法, 《中國藥典》(2000年版)增加了細菌內毒素檢查法應用指導原則, 《中國藥典》收載使用該法的品種逐版增加, 《中國藥典》(2010年版)［1］增至416個品種。

細菌內毒素檢查法靈敏度高, 受到許多因素的干擾。溶液pH值不適宜、二價陽離子不足、酶活性不足導致由內毒素激活的酶反應受抑制；內毒素標準品稀釋不當、器具吸附、放置時間過長內毒素自身聚集, 溫度、酸堿破壞引起的內毒素損耗都會出現假陰性結果。除內毒素外, β-葡聚糖也與鱟試劑發生反應, 生成凝膠, 出現假陽性結果。結合自己的工作體會, 總結了鱟試驗中的幾點注意事項。

1 鱟試劑

1.1鱟試劑靈敏度復核 《中國藥典》規定每批鱟試劑在用于試驗前應復核靈敏度。鱟試劑在生產、銷售、運輸、貯藏、使用等過程中, 易受到外界因素的影響, 如溫度、光線、時間等, 使促凝活性降低。尤其是不同廠家或不同批號的產品不同生產廠家的鱟試劑, 即使標示靈敏度相同, 檢測同一檢品時, 也可能出現不同結果。因而先核對靈敏度可避免因鱟試劑造成的判斷失誤。

1.2美國藥典要求應使用經特殊制備、不與β-葡聚糖反應的鱟試劑檢測含葡聚糖的樣品(如右旋糖酐20葡萄糖注射液、右旋糖酐40氯化鈉注射液等)。我國藥典沒有類似規定, 在鱟試劑選擇上要慎重。含葡聚糖的樣品若出現陽性結果, 應高度重視, 使用抗增液復溶鱟試劑可排除這種干擾。

2 鱟試劑的正常反應需中性的pH值、一定濃度的鈉離子和二價陽離子

2.1pH值 鱟試驗的反應混合液pH值應在6~8范圍內。用細菌內毒素檢查用水在容許范圍內稀釋供試品。用酸、堿或緩沖液調節pH值。供試品稀釋倍數太大、內毒素含量太低、鱟試劑靈敏度不夠, 造成假陰性結果。試驗前一定要計算最大有效稀釋倍數。調節pH值使用強酸、強堿和pH劑。pH試紙準確度不夠。弱酸、弱堿調節時用量較大, 可能引入較多的內毒素。

2.2樣品中含有螯合劑時, 使用硫酸鎂緩沖劑稀釋樣品可維持二價陽離子濃度。

2.3加熱或超濾可除去蛋白和酶的影響。

2.4實驗器具 實驗器具應充分洗滌并沖洗干凈, 特別是接觸酸堿或用洗衣粉、洗液等洗滌后, 更應沖洗干凈, 以免殘留物破壞極微量的內毒素。避免使用對內毒素有吸附作用的實驗器具, 所以最好是使用專用器具。

2.5在內毒素標準品配制和使用過程中, 經常使用漩渦混合器, 避免內毒素自身聚集。內毒素標準品溶液保存的溫度、時間、濃度應經驗證確認, 若使用頻率低, 最好現配現用。

2.6試驗用的試管架最好專門定制, 孔徑應與安瓿或試管直徑相接近, 避免左右晃動。保溫過程中不可隨時取出觀察,防止試管受到振動后造成凝膠變形而誤判為陰性。溫度對鱟試劑的靈敏度影響很大, 隨著溫度的升高以及延長保溫時間,鱟試劑的靈敏度亦增大, 增加假陽性。溫度過高會破壞鱟試劑。應控制在(37±1)℃之間, 保溫(60±2)min。細菌內毒素測定儀可以較好的滿足以上條件。

2.7操作時應將手用酒精消毒, 安瓿開啟前應先用砂石劃痕(不管是色點或包環易折安瓿), 用手半拉半掰將頸部折斷,千萬不能用鑷子敲擊, 防止碎玻屑掉入安瓿。在鱟試劑的溶解、樣品的稀釋及加入時, 取樣均應準確, 緩緩加入避免氣泡。雙手避免在安瓿或試管的上方來回移動, 加樣后用封口膜迅速封閉管口, 操作要快, 否則易致假陽性的出現。

［1］ 國家藥典委員會.中國藥典(一部).北京：中國醫藥科技出版社, 2010.

2014-05-05］

625000 雅安市食品藥品檢驗所