生長因子對硫酸鹽還原菌EPS產生及其吸附Cu2＋性能的影響

李明明， 虞艷云， 王 進， 李 青， 岳正波

（合肥工業大學 資源與環境工程學院，安徽 合肥 230009）

硫酸鹽還原菌（sulfate reducing bacteria，簡稱SRB）是一類形態、營養多樣化的厭氧異養細菌［1］。文獻［2－3］研究表明，SRB菌可以有效地去除廢水中的重金屬離子，并在處理礦山酸性排水中具有重要作用。隨著研究的不斷深入，人們發現SRB胞外聚合物（extracellular polymeric substances，簡稱EPS）在處理重金屬的過程中占有重要作用。文獻［4］認為EPS在生物修復重金屬中起核心作用；文獻［5］研究從海水中分離一株SRB，在液體培養時其分泌的EPS與Ni2＋、Cr6＋與Mo2＋形成配體，可以有效去除這幾種重金屬。

EPS是微生物在生長過程中分泌的一種由多糖、蛋白質等許多高分子物質組成的聚合物［6－7］。EPS含有大量陰離子基團（羧基、羥基及氨基等）［8］，可以和重金屬離子進行吸附或螯合等作用［9－10］。文獻［11］研究 Mn2＋、Mo6＋和Zn2＋對活性污泥內EPS組分的影響，結果表明低質量濃度（0.05mg／L）Mn2＋導致EPS中蛋白質、多糖和核酸的含量下降，Zn2＋會對EPS中多糖含量造成影響，Mo6＋對EPS各組分沒有顯著影響。文獻［12］研究pH值對EPS吸附重金屬的影響，發現有30%的重金屬吸附到EPS上是不可逆的。

隨著人們對EPS研究的深入，如何調節EPS的成分和含量已經成為目前一個現實的問題。大量研究表明培養時間、基質、pH值等生長因子可以影響細菌EPS的分泌。文獻［13］分別研究了培養時間、C／N比等對Rhodopseudomonasacidophila分泌EPS的影響；文獻［14］研究了環境因素對Pediococcusparvulus2.6分泌EPS的影響；文獻［15］研究了pH值、接種量、培養時間等對PseudomonasfluorescensPGM37菌EPS分泌的影響。近年來，采礦、金屬冶煉、電鍍以及IT等行業會大量排放含Cu廢水，其中Cu2＋的含量普遍在幾十至上百 mg／L［16－17］，Cu污染問題亟待有效解決。因此，本文首先研究了不同生長因子對SRB菌分泌EPS的影響，繼而進一步考察了不同生長因子作用下SRB菌分泌的EPS對Cu2＋的吸附性能。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

此菌株為硫酸鹽脫硫弧菌（Desulfovibrio desulfurican），是由本課題組從合肥市某污水處理廠底部厭氧發酵污泥中分離得到，鑒別號為：HQ022824.1。實驗所用培養基是Starkey培養基，具體成分為：K2HPO40.5g，NH4Cl 1.0g，Na2SO40.5g，CaCl20.1g，MgSO42.0g，70%乳酸納5.0mL，蒸餾水1 000mL，抗壞血酸1%，pH＝7.0±0.2。

1.2 實驗設計

1.2.1 生長因子對SRB菌分泌wEPS影響

pH 值、接種菌 體濃 度 （TS），w（F／M）和ρ（COD）／ρ（SO42－）是影響SRB生長代謝的重要生長因子。大量研究表明，pH值在6.5～8.0，接種菌體濃度在10%（本研究以TS的量表示接種濃度，在接種菌體濃度為10%時接種TS為45mg／L左右），加入乳酸鈉的質量比在63.5～90g／g，ρ（COD）／ρ（SO42－）值在2.0～2.5之間時，SRB 的生 長 代 謝 最 佳［18－21］，但 是 相 關文 獻 并沒有對EPS的產生量進行研究。因此根據文獻報道并結合本株菌自身的生長狀況選取較寬泛的取值范圍，利用序批式實驗研究不同pH值、接種菌體濃度（TS），F／M 和COD／SO42－值對SRB產EPS的影響。具體設計見表1所列。

表1 不同生長因子實驗設計

實驗在磨口錐形瓶中進行，接種前在無菌條件下向培養基中充氮氣以排除氧氣。接種后置于35℃恒溫培養箱中培養44h。反應結束后，測量OD600、EPS含量；對于不同F／M實驗，測定反應前后的COD。

1.2.2 EPS對Cu2＋的吸附實驗

分別取不同影響因子下SRB菌分泌的EPS 10mL置入透析袋中，再將透析袋放入含有40mg／L Cu2＋溶液的燒杯中透析24h，然后將透析袋置入蒸餾水中以去除透析袋內游離的Cu2＋，反應結束后測量EPS和透析液中的Cu2＋含量。整個吸附過程在pH＝5的條件下進行以保證體系中的Cu以離子狀態存在。

1.3 分析方法

培養結束后將菌液于4℃、4 000r／min下離心15min，取上清液測定SO42－質量濃度和COD質量濃度；離心所得沉淀物用蒸餾水清洗后用加熱法提取EPS。首先將沉淀物于80℃水浴中加熱10min，然后在4 ℃、14 000r／min下離心15min，取上清液用0.22μm的纖維素膜過濾，將濾液置入3 500Da的半透膜中透析24h以獲得EPS樣品。

EPS中多糖采用蒽酮法，蛋白質采用lowery法，核酸采用紫外分光光度法測定。重金屬Cu2＋使用TAS－986型原子吸收分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）測定；SO42－采用鉻酸鋇分光光度法測定；COD采用重鉻酸鉀法測定。EPS的紅外光譜采用傅里葉紅外光譜儀（Nicolet 67，美國Thermo Nicolet公司）測量。紅外樣品的制備方法采用吸附壓片法［22］。先將KBr溶解于EPS溶液中，再緩慢蒸發使其析出，此時EPS吸附在KBr上，再將析出物加KBr研磨后壓片，即可上機測試。掃描波長為800～4 000cm－1。

2 實驗結果與討論

2.1 pH對SRB分泌EPS的影響

pH值對SRB分泌EPS的影響及EPS對Cu2＋的吸附如圖1所示。從圖1a中可以看出，當初始溶液為中性的條件下EPS的產率最高；當pH上升時，EPS產率略微下降；在pH＜7時，EPS產率下降趨勢明顯；當pH＜5時，由于SRB死亡，無EPS產生（圖中未顯示）。這是由于在酸性條件下，羧基、多聚糖酚類和蛋白質肽鍵消失；而在堿性的條件下，這些基團基本上不受影響［23］。因此，在酸性條件下，EPS隨著pH值的上升而上升；在堿性條件下EPS隨pH值變化并不明顯。

不同初始pH值下SRB產生的EPS對Cu2＋的吸附效果如圖1b所示，在接近中性的條件下產生的EPS對Cu2＋的吸附性能較強，并于pH＝8時產生的EPS對Cu2＋的吸附效果最佳。在所研究的pH值范圍內，當初始pH值為5或9時培養的SRB產生的EPS對Cu2＋的吸附性能不佳。這可能是因為在低的pH值下溶液中的H＋會和羥基等基團結合，而pH值高時溶液中OH－會與羧基等基團發生反應，因此溶液中Cu2＋要通過競爭作用才能與這些基團結合［24］，從而導致吸附量降低。

圖1 pH值對SRB分泌EPS的影響及EPS對Cu2＋的吸附

2.2 接種TS對SRB分泌EPS的影響

接種TS對SRB分泌EPS的影響及EPS對Cu2＋的吸附如圖2所示。

從圖2a中可以看出隨著初始接種TS的增加，EPS的產率呈不規則變化。總體來說在低（ρ（TS）＝18.2mg／L）和高（ρ（TS）＝182mg／L）的初始接種TS情況下EPS產率較高。微生物在生長過程中分泌EPS附著在細胞周圍，就像一個細胞壁外的類凝膠層，以延遲擴散的方式延遲或者防止毒性物質和微生物接觸或者用化學方法減少毒性物質的傷害［25］。在底物質量濃度不變的情況下，高的接種量意味著高的細菌本底值，底物消耗加快，細菌更早地進入衰亡期，在此階段會伴有較多細菌胞內物質的溶出和有毒物質積累［26］。雖然在衰亡期釋放到溶液中的EPS含量較多［27］，但是在高的接種量下由于細胞內物質溶出與有毒物質刺激EPS的含量仍較高。在低的接種量下由于底物質量濃度相同，微生物有更大的生長空間，相比于其他接種量下此時SRB活性較高，因而釋放到溶液中的EPS更少［27］。所以在低的接種量下EPS的含量也較高。不同接種TS條件下SRB分泌的EPS對Cu2＋的吸附如圖2b所示，接種質量濃度過高或過低的條件下產生的EPS均不利于對Cu2＋的吸附，總體來說，接種TS處于36.4～136.5mg／L之間時細菌產生的EPS相比于高和低的接種質量濃度下產生的EPS對Cu2＋具有更強的吸附能力。在高的接種量下由于SRB處于不利的生長條件下，產生的EPS會抵抗外部不利因素。由此推測，EPS的吸附位點會在此過程中遭到破壞，造成吸附量的降低；低的接種量下細菌適應期延長，雖然會分泌大量的EPS，但是EPS的吸附性能和SRB的活性均保持在較低水平。

圖2 接種TS對SRB分泌EPS的影響及EPS對Cu2＋的吸附

2.3 初始F／M對SRB分泌EPS的影響

初始F／M對SRB分泌EPS的影響 及EPS對Cu2＋的吸附如圖3所示，其中F／M為COD／TS。

圖3 初始F／M對SRB分泌EPS的影響 及EPS對Cu2＋的吸附

從圖3a中可以看出當w（F／M）從18.1上升到136.0時，EPS的產率出現明顯降低；當w（F／M）超過136.0后，EPS的產率基本上不發生變化。這表明在微生物長勢不佳的情況下，SRB分泌的EPS較多。因為在接種量不變的情況下，初始COD的質量濃度越低，細菌可利用的營養物質缺乏，細菌更早地進入衰亡期，有毒物質滋生，因此會刺激SRB菌分泌更多的EPS保護細胞［28］。當初始COD質量濃度增加到一定程度后，SRB有足夠的碳源，因此分泌的EPS無明顯變化。

不同w（F／M）下SRB分泌的EPS對Cu2＋的吸附性能如圖3b所示。當初始w（F／M）在0～90.7范圍內，從SRB菌中提取的EPS對Cu2＋的吸附效果顯著，在低的C源下，雖然會分泌大量的EPS，但是吸附Cu2＋的效果不佳，推測EPS中吸附位點可能會被生長過程中產生的毒性物質破壞，導致其吸附量較低；而隨著C源的增加，有毒物質積累緩慢，EPS的吸附位點增多，吸附Cu2＋的量也隨之增多；當C源的含量超過一定值時，SRB菌生長穩定，在沒有不利條件的刺激下細菌分泌的EPS量相對較少且組成成分變化不大，從而吸附Cu2＋的量也減少且無明顯差異。

2.4 不同初始ρ（COD）／ρ（SO42－）的影響

不同ρ（COD）／ρ（SO42－）對SRB分泌EPS的影響及EPS對Cu2＋的吸附如圖4所示。

如圖4a所示，ρ（SO42－）對SRB分泌EPS的影響顯著。在ρ（COD）／ρ（SO42－）為3∶0.3條件下，SRB沒有充分的電子受體，生長條件惡劣，會分泌較多的EPS來保護細胞，此時由于細菌處于衰亡期，釋放到溶液中的相對較多，所以此時EPS含量并未達到最大；當ρ（COD）／ρ（SO42－）為3∶1.0時，EPS分泌量達到最大。當超過這一比值后，體系中有足夠的SO42－供SRB生長利用，細菌在生長過程受到的外界刺激弱，所以產生的EPS的含量降低。

圖4b所示的是不同SO42－質量濃度下SRB產生的EPS對Cu2＋的吸附性能。在不同初始SO42－質量濃度下產生的EPS對Cu2＋的吸附量具有明顯差異，在研究的范圍內，隨著初始SO42－質量濃度升高，SRB菌產生的EPS對Cu2＋的吸附能力逐漸降低。

圖4 不同ρ（COD）／ρ（SO42－）對SRB分泌EPS的影響及EPS對Cu2＋的吸附

2.5 FTIR圖譜分析

吸附前后EPS的紅外光譜圖如圖5所示，掃描波數為800～4 000cm－1。3 412cm－1處為—NH2伸縮振動峰；3 479cm－1處為—NH伸縮振動峰，3 555cm－1為—OH伸縮振動產生的峰；1 655cm－1處是C＝O和C—N伸縮振動峰（酰胺Ⅰ帶）；1 378cm－1處是多糖羧基中C＝O對稱振動；1 109cm－1處C—O伸縮振動峰，1 034cm－1處是P＝O振動峰為核酸的磷酸二酯骨架或C—OH振動峰為磷酸化的蛋白質；991cm－1處為C—O—C振動峰。EPS的FTIR光譜顯示其含有眾多蛋白質和多糖的官能團，進一步證實了其生物化學組成［6，29，30］。

圖5 吸附前后EPS的FTIR圖

與吸附前相比，吸附Cu2＋之后的FTIR峰在峰位置及強度上均發生改變。表征蛋白質的特征峰：3 479cm－1處—NH2峰消失，表明—NH2與Cu2＋發生配位作用；3 412cm－1處—NH峰偏移到3 420cm－1處，1 613cm－1處C＝O和C—N峰偏移到1 655cm－1處，1 109cm－1處C—O峰偏移到1 092cm－1處，并伴有峰強度的改變。3 555cm－1處—OH、1 378cm－1處C＝O表征多糖的特征峰、1 034cm－1處表征核酸的特征峰未發生明顯偏移，只是峰強度發生改變。這些結果表明在SRB菌EPS對Cu2＋吸附過程中，蛋白質的作用要強于多糖。

3 結 論

（1）在pH＝7、初始接種 TS為182mg／L、w（F／M）為18.1和ρ（COD）／ρ（SO42－）為3∶1.0的條件下硫酸鹽分泌的EPS最多。

（2）在pH＝8、初始接種TS為136.5mg／L、w（F／M）為45.3和ρ（COD）／ρ（SO42－）為3∶0.3的條件下，對硫酸鹽還原菌進行培養獲得的EPS對Cu2＋的吸附性能最佳。

（3）EPS對Cu2＋吸附過程中，蛋白質作用強于多糖。

［1］肖利萍，張 鐳，李 月.硫酸鹽還原菌及其在廢水厭氧治理中 的 應 用 ［J］.水 資 源 與 水 工 程 學 報，2011，22（1）：45－49.

［2］王 進，侯成虎，陳 靜，等.SRB以油菜秸稈為基質處理酸性礦山排水［J］.合肥工業大學學報：自然科學版，2012，35（12）：1676－1680.

［3］葛曉光，楊 柳，彭申華，等.一株煤礦地下水硫酸鹽還原細菌的分離、鑒定及性質研究［J］.合肥工業大學學報：自然科學版，2011，34（3）：420－423.

［4］Arundhati P A K P.Microbial extracellular polymeric substances：central elements in heavy metal bioremediation［J］.Indian Journal of Microbiology，2008，48（1）：49－64.

［5］Beech I B，Cheung C W S.Interactions of exopolymers produced by sulphate reducing bacteria with metal ions［J］.International Biodeterioration and Biodegradation，1995，35（1／2／3）：59－72.

［6］Cao Y Y，Wei X，Cai P，et al.Preferential adsorption of extracellular polymeric substances from bacteria on clay minerals and iron oxide［J］.Colloids and Surfaces B：Biointerfaces，2011，83（1）：122－127.

［7］Shen R，Sheng G P，Yu H Q.Determination of main components in the extracellular polymeric substances extracted from activated sludge using a spectral probing method［J］.Colloids and Surfaces B：Biointerfaces，2012，94（1）：151－156.

［8］Kim S Y，Kim J H，Kim C I，et al.Metal adsorption of the polysaccharide produced fromMethylobacteriumorganophilum［J］.Biotechnology Letters，1996，18（10）：1161－1164.

［9］Zheng Y，Fang X L，Ye Z L，et al.Biosorption of Cu（II）on extracellular polymers fromBacillussp.F19［J］.Journal of Environmental Sciences，2008，20（11）：1288－1293.

［10］Liu Y，Lam M C，Fang H H P.Adsorption of heavy metals by EPS of activated sludge［J］.Water Science and Technology，2001，43：59－66.

［11］曹相生，龍騰銳，孟雪征，等.Mn2＋、Mo6＋和Zn2＋對活性污泥內胞外聚合物組分的影響［J］.環境科學，2004，25（4）：70－73.

［12］Gilles G，Francois B，Asmaa S，et al.Effect of pH on cadmium and lead binding by extracellular polymeric substances （EPS）extracted from environmental bacterial strains［J］.Colloids and Surfaces B：Biointerfaces，2008，63（1）：48－54.

［13］Sheng G P，Yu H Q，Yue Z B.Factors influence the production of extracellular polymeric substances ofRhodopseudomonasacidophila［J］.International Biodeterioration and Biodegradation，2006，58（2）：89－93.

［14］Velasco S，Arsk¨old E，Paese M，et al.Environmental factors influencing growth of and exopolysaccharide formation byPediococcusparvulus2.6［J］.International Journal of Food Microbiology，2006，111（3）：252－258.

［15］Zhao L，Fan F，Wang P，et al.Culture medium optimization of a new bacterial extracellular polysaccharide with excellent moisture retention activity［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2013，97（7）：2841－2850.

［16］Sheng Y X，Cao H B，Li Y P，et al.Effects of various pretreatments on biological sulfate reduction with waste acti－vated sludge as electron donor and waste activated sludge diminution under biosulfidogenic condition［J］.Journal of Hazardous Material，2010，179（1－3）：918－925.

［17］易正戟，譚凱旋，澹愛麗，等.硫酸鹽還原菌及其在工業和礦山廢水治理中的應用［J］.云南師范大學學報：自然科學版，2006，26（3）：39－46.

［18］萬海清，蘇仕軍，朱家驊，等.硫酸鹽還原菌的生長影響因子及脫硫性能的研究［J］.高校化學工程學報，2004，18（2）：218—223.

［19］馬忠友，鄧 盾，汪建飛，等.一組混合菌群還原硫酸鹽的特性［J］.中國農學通報，2013，29（8）：184—188.

［20］鄭 強.生態因子對硫酸鹽還原菌生長的影響［J］.中國資源綜合利用，2009，27（2）：25—27.

［21］李建軍，葉廣運，陳進林，等.一株硫酸鹽還原菌的分離鑒定和系統發育分析［J］.微生物學通報，2009，36（10）：1476－1482.

［22］謝狄霖，陳 忠.含水物質紅外光譜測試的樣品制備［J］.分析儀器，2003（4）：52－53.

［23］鄭 蕾，田 禹，孫德智.pH值對活性污泥胞外聚合物分子結構和表面特征影響研究［J］.環境科學，2007，28（7）：1507－1511.

［24］Yin Y R，Hu Y Y，Xiong F.Sorption of Cu（II）and Cd（II）by extracellular polymeric substances（EPS）fromAspergillusfumigatus［J］.International Biodeterioration and Biodegradation，2011，65（7）：1012－1018.

［25］Wingender J，Neu T R，Flemming H C.Microbial extracellular polymeric substances：characterization，structures and function［M］.Berlin：Springer－Verlag 1999：30－31.

［26］陳劍虹.環境工程微生物學 ［M］.第2版.武漢：武漢理工大學出版社，2009：79－80.

［27］Xu H C，Cai H Y，Yu G H，et al.Insights into extracellular polymeric substances of cyanobacterium Microcystis aeruginosa using fractionation procedure and parallel factor analysis ［J］.Water Research，2013，47 （6）：2005－2014.

［28］Aquino S F，Stuckey D C.Soluble microbial products formation in anaerobic chemostats in the presence of toxic compounds［J］.Water Research，2004，38（2）：255－266.

［29］方 迪，張瑞昌，趙陽國.硫酸鹽還原菌分泌胞外多聚物吸附 Cu2＋的特性［J］.光譜學與光譜分析，2011，31（10）：2819－2823.

［30］Sheng G P，Yu H Q，Wang C M.FTIR－spectral analysis of two photosynthetic H2－producing strains and their extracellular polymeric substances［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2006，73（1）：204－210.