禽流感診斷和監測拭子樣品的采集、運輸和保存

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（1.東北農業大學，黑龍江哈爾濱 150000；2.中國動物衛生與流行病學中心，山東青島 266032）

禽流感診斷和監測拭子樣品的采集、運輸和保存

張笑春1，劉 朔2，莊青葉1，黃保續2，陳繼明2

（1.東北農業大學，黑龍江哈爾濱150000；2.中國動物衛生與流行病學中心，山東青島266032）

禽流感拭子樣品的采集、運輸和保存對禽流感病原學診斷和監測很重要。本文介紹了這方面的國際和國內標準，分析了近年來這方面研究進展，最后總結出較優的禽流感診斷和監測拭子樣品采集、運輸和保存方法，以期為我國禽流感病原學診斷和監測提供參考。

禽流感；拭子樣品；采集；運輸；保存

禽流感病毒是一類重要的病原，能夠引起家禽大量發病和死亡。有些禽流感病毒還能感染人，引起人發病死亡。例如，2013年中國出現的H7N9型禽流感已經引起300多個人間病例，其中約有1/3為死亡病例。禽流感病毒具有亞型多和變異快的特點，使禽流感防控難度極大。開展禽流感病原學監測，快速和準確地檢測禽流感病毒感染，對于禽流感防控工作極為重要。在禽流感病毒檢測和監測過程中，采集、運輸和保存可能帶有禽流感病毒的宿主咽喉拭子、泄殖腔拭子、糞便或環境拭子樣品。這些過程會影響實驗室檢測和監測的靈敏度。近年來，在禽流感拭子樣品的采集、運輸和保存方面的研究取得了一些進展，現就這些研究進展進行綜述，如下：

1 樣品采集

1.1 拭子類型

根據拭子材料和制作工藝的不同，目前主要有普通醫用棉簽、聚酯纖維拭子、聚丙烯纖維拭子、聚乙烯棉簽、尼龍（聚酰胺纖維）植絨拭子、聚氨酯泡沫拭子和非植絨滌綸拭子等。植絨（focked）是利用電荷的自然特性產生的一種生產新工藝，其原理是利用電荷同性相斥異性相吸的物理特性，使絨毛帶上負電荷，把需要植絨的物體放在零電位或接地條件下，絨毛受到異電位靶物體的吸引，呈垂直狀加速飛升到靶物體表面上，由于靶物體涂有膠粘劑，絨毛就被垂直粘在靶物體上。如今對禽流感病毒進行檢測和監測，常用的樣品采集拭子主要是以脫脂棉為原材料制成的醫用棉簽。

WHO推薦采集人喉鼻拭子時選用聚酯纖維拭子[1]。我國國家標準（CNICSOP07001）建議采集人呼吸道樣品時選用聚丙烯纖維頭拭子[2]；我國農業行業標準（NY/T 765-2004）規定采集禽糞便或泄殖腔拭子樣品時，可使用棉質、聚乙烯或滌綸材質的滅菌棉簽，但所采集樣品用于病毒核酸定量檢測時則最好選用滌綸材質的滅菌棉簽[3]。

Fereidouni SR等[4]曾用尼龍植絨和人造纖維兩種類型拭子采集禽流感樣品，運用real-time RTPCR方法進行檢測，對比發現兩種拭子產生相似的Ct值，適用性相同。Spackman E等[5]分別采用尼龍植絨、非植絨滌綸（聚酯纖維）和聚氨酯泡沫等三種類型的拭子，采集雞禽流感和新城疫樣品，并利用病毒分離、real-timeRT-PCR和商業抗原檢測分析的方法對其進行比較，結果發現尼龍植絨和聚氨酯泡沫拭子的效果優于非植絨滌綸拭子，能夠更好捕捉大量樣品并將其釋放到采樣液中。Killian ML[6]對棉簽柄的材質進行分析，發現木柄表面物質會影響病毒活性，抑制病毒核酸分離，影響檢測結果，因此建議采集禽流感拭子樣品時使用塑料柄聚酯棉簽。此外，已經證實醫學常用的生物活性物質的穩定劑——海藻糖不適合處理拭子，該物質會使病毒失活，病毒滴度在48h內會降低1000倍[7]。

1.2 采樣保存液

采集禽流感拭子樣品所用的采樣保存液一般由用于培養細胞和細菌的基礎緩沖液、平衡鹽溶液或蛋白緩沖液及抗生素組成。根據采集樣品的不同，采樣保存液中使用的抗生素種類及用量可進行相應調整。

WHO推薦配方：小牛浸液肉湯10g 、牛血清白蛋白V 2g、無菌蒸餾水400 mL、硫酸慶大霉素溶液（50 mg/mL）0.8 mL、兩性霉素B（250μg/L）3.2mL。該采樣保存液適用于收集人的喉、鼻拭子[1]。我國國家標準（CNICSOP07001）推薦配方：①呼吸道樣品保存液：Hank’s/MEM液（pH 7.4-7.6）400 mL、慶大霉素（50 mg/mL）0.8 mL、多粘菌素B（250 μg/mL）3.2 mL；②糞便樣品保存液：1L MEM 中加入7.5%牛血清白蛋白V、青霉素、鏈霉素、慶大霉素、多粘菌素B、制霉菌素和氧氟沙星，使終濃度分別達到0.5%、2×106U/L、200 mg/L、250 mg/L、2×106U/L、50μg/mL和60 mg/L[2]。調節pH至7.4，分裝2～3 mL/管，-20℃凍存。

OIE和我國農業行業標準（NY/T 765-2004）均建議保存禽咽喉拭子、泄殖腔拭子和糞便拭子樣品采用加有抗生素的等滲PBS （0.01 mol/L，pH 7.4）作為采樣保存液。配方如下：每1L含NaCL 8.0g、KH2PO40.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、KCL 0.2g。調pH至7.4，高壓滅菌后，于4℃備用。我國農業行業標準建議加入抗生素及濃度：青霉素（2000 IU/mL）、鏈霉素（2 mg/mL）、丁胺卡那霉素（1000 IU/mL）、制霉菌素（1000 IU/mL）；除慶大霉素（50 μg/mL）替代丁胺卡那霉素外，OIE建議采樣保存液抗生素種類及用量與農業行業標準一致。喉氣管和口咽拭子加入上述濃度抗生素的保存液即可，糞便和泄殖腔拭子所需抗生素濃度應提高5倍[3，8]。美國國家獸醫實驗室（NVSL）采集禽氣管和泄殖腔拭子樣品時使用不含抗生素的BHI （Brain heart infusion）肉湯作為采樣保存液（這些樣品既可用于病毒的分離，也可用于細菌的分析），同時也建議使用蛋白緩沖液，如胰蛋白胨或蛋白胨肉湯等，其中蛋白可防止病毒降解，增加病毒穩定性[6]。Spackman E等[5]針對禽流感和新城疫拭子樣品，采用病毒分離、real-time RT-PCR和商業抗原檢測分析的方法，對BHI和PBS采樣保存液進行比較，發現BHI比PBS效果好。考慮到成本等諸多方面問題，國內對活禽進行禽流感拭子樣品采集時，普遍使用我國農業行業標準推薦的采樣保存液。然而，采集人的咽拭子或肛門拭子時，則多使用國標推薦的采樣保存液。

2 樣品運輸和保存

2.1 運輸方式

如何運輸采集的拭子樣品，相關標準并沒有對其進行詳細說明。Spackman E等[5]將禽流感和新城疫拭子樣品，分別使用濕拭子運輸、干拭子運輸和運輸前將拭子從采樣保存液中取出這三種運輸方式，用病毒分離、real-time RT-PCR和商業抗原檢測分析的方法進行評估，結果表明濕拭子運輸比干拭子運輸效果好，在運輸前是否移除拭子，對病毒的檢測沒有明顯影響。Killian ML[6]認為干拭子運輸會降低禽流感病毒的分離率，建議采用濕拭子運輸。Roelandt S等人[9]采集北京鴨的口咽和泄殖腔拭子，并采用運輸干、濕拭子兩種方式，利用RTPCR方法進行病毒檢測，結果發現口咽拭子采用濕拭子運輸效果較好；泄殖腔拭子則采用干拭子運輸效果較好；但兩種運輸方式對禽的定性檢測沒有影響。

2.2 溫度

溫度是影響禽流感拭子樣品運輸和保存的主要因素。樣品運輸和保存過程中，能否保持病毒活性，對禽流感檢測是非常重要的。

WHO規定：樣品進行病毒分離檢測時，4℃可以保存2天，超出2天則需置于-70℃保存；干冰冷藏運輸時，干冰需密閉包裝，以防止揮發出的CO2影響病毒活性[10]。我國國家標準（CNICSOP07001）要求樣品短途運輸可加冰保冷，長途運輸需加干冰。糞便樣品檢測方式不同，推薦的保存溫度也不同，如，進行病毒核酸檢測時推薦保存溫度為-70℃、-20℃和4℃，7天以內也可室溫保存；進行病毒分離實驗時，建議-70℃保存，4天以內也可置于4℃保存[2]。我國農業行業標準（NY/T 765-2004）建議樣品在4h以內采用冰袋運輸，若4～24h內能送至實驗室可-30℃冷凍再用保溫箱加冰袋運輸，〉24h送至實驗室，則應在-20℃以下保存運輸。若送至實驗室，不進行樣品處理，應在-70℃或更低溫度下保存，避免反復凍融[3]。OIE推薦長期儲存樣品的最佳溫度為-140℃，-80℃或-20℃可以保存樣品5～10年[11]。

Dundon WG等[12]將瓶裝凍干禽流感抗原和抗血清制劑置于4℃、22℃和37℃保存，并選取第0、3、7、14和21天分別進行HA、HI和瓊擴試驗。結果表明，凍干的禽流感抗原在4℃和22℃保存21天仍存在血凝活性；用于瓊擴試驗的抗原和抗體在4℃和37℃保存21天可維持穩定。Fereidouni SR等人[4]證實，禽流感拭子樣品在4℃和20℃恒溫可保存兩周，但溫度變化對病毒的影響很大。Killian ML[6]建議不要在0℃保存樣品，以盡量避免反復凍融；拭子樣品可在4℃保存一周，-20℃或更低溫度下可保存幾周到數月。

3 結論

目前，禽流感監測方法已經建立，并成功應用于許多國家。但是，針對禽流感拭子樣品采集、運輸和保存這方面的內容很少，沒有足夠的文獻支持，且采集方法標準不統一，常根據家禽種類、監測目標以及材料的成本而發生變化，而統一的標準采樣方法可以使禽流感監測更加準確。本文參考現有標準，結合前人實驗結果，認為采集禽流感拭子樣品適宜選擇塑料柄的尼龍植絨、聚氨酯泡沫、人造纖維拭子，建議使用BHI作為采樣保存液，采用濕拭子運輸，可用干冰冷藏運輸。此外，樣品可在4℃保存2天；超出2天置于-20℃可保存一周至數月；-70℃可保存5～10年。且盡量避免反復凍融。

[1] World Health Organization. WHO guidelines for the collection of human specimens for laboratory diagnosis of avian infuenza infection[J]. GENEVA：WHO，2005.

[2] 張燁，薄洪. CNICSOP07001，國家流感中心標準操作規程（修訂版）[S] 北京：中國疾病預防控制中心病毒預防控制所，2007.

[3] 中華人民共和國農業部. NY/T 765-2004 高致病性禽流感樣品采集、保存及運輸技術規范[S]. 北京：中國農業出版社，2004-02-17.

[4] Fereidouni S R，Globig A，Starick E，et al. Effect of Swab Matrix，Storage Time，and Temperature on Detection of Avian Infuenza Virus RNA in Swab Samples[J]. Avian diseases，2012，56（4s1）：955-958.

[5] Spackman E，Pedersen J C，McKinley E T，et al. Optimal specimen collection and transport methods for the detection of avian infuenza virus and Newcastle disease virus[J]. BMC veterinary research，2013，9（1）：35.

[6] Mary Lea Killian BS M S. Avian influenza virus sample types，collection，and handling[M] Avian Influenza Virus. Humana Press，2008.

[7] Johnson F B. Transport of viral specimens[J]. Clinical microbiology reviews，1990，3（2）：120-131.

[8] Manual O I E T. Chapter 2.3. 4.—Avian infuenza[J]. 2009.

[9] Roelandt S，Outtrim L，Browning C，et al. Evaluation of two different swab transport systems in the detection of avian influenza virus excretion from infected Pekin ducks （Anasplatyrhynchos）[J]. Journal of virological methods，2012，184（1）：8-14.

[10] World Health Organization. WHO laboratory biosafety guidelines for handling specimens suspected of containing avian infuenza A virus[J]. GENEVA：WHO，2005.

[11] Offce International Des Epizooties. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals[M]. 7th ed. PARIS：OIE，2012.

[12]Dundon W G，Boscarato L，Mazzacan E，et al. Effect of different temperatures on the stability of avian infuenza reference reagents[J]. Avian diseases，2007，51（s1）：366-369.

Collection，Transportation and Preservation of Swab Samples for Diagnosis and Surveillance of Avian Infuenza

Zhang Xiaochun1，Liu Shuo2，Zhuang Qingye1，Huang Baoxu2，Chen Jiming2

（1. Northeast Agricultural University，Harbin，Heilongjiang 150000；
2.China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao 266032）

Collection，transportation and preservation of swab samples are important for the diagnosis and surveillance of avian infuenza. The international and national standards and some recent researches in this feld were reviewed here，and the optimal methods were proposed for collection，transportation and preservation of swab samples for diagnosis and surveillance of avian infuenza，so as to provide reference for the diagnosis and surveillance of avian infuenza.

Avian infuenza； Swab samples；Collection；Transportation；Preservation

S855.3 < class="emphasis_bold">文獻標識碼：A

A

1005-944X（2014）07-0030-04

陳繼明