急性肝衰竭動物模型的研究進展

瞿葉清

(南京大學醫學院附屬鼓樓醫院動物實驗中心，江蘇 南京 210008)

綜述與專論

急性肝衰竭動物模型的研究進展

瞿葉清

(南京大學醫學院附屬鼓樓醫院動物實驗中心，江蘇 南京 210008)

急性肝衰竭是一種伴隨多種臨床癥狀的嚴重肝損傷疾病，死亡率高，治療難度大，因此制備急性肝衰竭動物模型以進行治療研究就顯得非常必要。本文綜述了適用于不同種類實驗動物的急性肝衰竭模型的制備方法。

急性肝衰竭；模型，動物

急性肝衰竭(acute hepatic failure，AHF)是指由多種因素引起的肝功能損傷，它是可危及生命的嚴重疾病，其臨床表現通常包括肝功能異常、肝臟生化指標異常、凝血功能障礙，多達一半的病例可進展為肝性腦病、多器官功能衰竭和發生死亡。

AHF死亡率很高(>80%)，如何治療嚴重的AHF是當今臨床醫學中最具挑戰的難題之一。為了有效地治療AHF，制備與臨床發病情況類似并可復制的動物模型就顯得非常必要。本文總結了適用于不同種類實驗動物的AHF模型的制備方法，為其合理應用提供參考。

1 大鼠和小鼠AHF模型

大鼠是構建AHF動物模型最常用的實驗動物，品系以Wistar和SD為主。而小鼠ICR、C57BL/6、KM等多種品系均有報道，說明AHF造模對小鼠品系無嚴格要求。

因大、小鼠與豬、犬、兔相比體積很小，較少采用手術造模，目前主要應用肝毒性藥物造模。所應用的藥物主要有D-氨基半乳糖胺(D-galactosamine，D-GalN)、硫代乙酰胺(thioacetamide，TAA)、對乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)、四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)等。

1.1 D-氨基半乳糖胺(D-GalN)

D-GalN是一種肝細胞磷酸尿嘧啶核苷干擾劑，可造成肝彌漫性壞死和炎癥，大劑量可制造AHF。D-GalN進入體內后，能造成磷酸尿苷耗竭，使依賴其生物合成的核酸、糖蛋白、脂糖等物質合成受抑制，限制細胞器及酶的生成和補充，細胞器受損致使鈣離子內流，引起肝細胞變性、壞死。

D-GalN和脂多糖(LPS)聯合用藥是大、小鼠AHF模型最常用的方法之一。LPS是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分，D-GalN能加強LPS的急性毒性，而LPS能刺激巨噬細胞、枯氏細胞產生腫瘤壞死因子α(TNF-α)，TNF-α在LPS/D-GalN誘導的小鼠肝炎的早期階段能誘導肝細胞凋亡[1]。Wistar大鼠腹腔注射D-GalN 500 mg/kg、LPS 50μg/kg 3 h后，TNF-α水平顯著提高[2]。楊昊臻等[3]用C57BL/6j小鼠進行正交實驗，得出理想造模給藥方案為D-GalN 350 mg/kg、LPS 30 μg/kg，混合后稀釋3倍腹腔注射，6 h后可出現典型肝衰竭表現。Lin等[4]報道給C57BL/6j小鼠腹腔注射50μg/kgLPS和800 mg/kg D-GalN 1d1次，連續3 d可成功構建AHF模型。黃紹芳等[5]給KM小鼠腹腔注射D-GalN 600 mg/kg和LPS5μg/kg，2 h見少數點狀壞死，6 h匯管區與中央靜脈之間肝細胞索部分融合成片狀，細胞變性壞死，嗜酸性染色加強，胞質顆粒消失；至24 h，細胞完全壞死，未見正常肝細胞，細胞溶解出現大片壞死，小葉結構消失，肝竇出血，炎性細胞浸潤，有吞噬細胞碎片及色素；血清中TNF-α、IL-1β在6h達到頂峰，分別為(634.23±35.18)pg/mL和(688.91±48.27)pg/mL。潘慶軍等[6]比較了800 mg/kgD-GalN與不同劑量LPS給小鼠腹腔注射后的造模效果，最終確定LPS劑量以500 μg/kg最佳。

用D-GalN單一誘導也是構建大鼠急性肝衰模型的常用方法之一，但是在小鼠模型中鮮有報道。與LPS聯合應用相比，D-GalN的劑量大幅度增加。劉芳等[7]比較了1.2、1.4、1.6 g/kg三個劑量一次腹腔注射給藥于雌性SD大鼠后的AHF造模效果，注射后每12 h取血測定肝功能，發現48h后肝功能病理變化最為明顯，1.2 g/kg劑量組肝損傷未達到AHF程度，而1.6 g/kg組死亡率太高，因此認為1.4 g/kg劑量最為合適。Zhang等[8]也試驗證明，1.4g/kg這個劑量構建的AHF模型的臨床表現、血清學、組織學變化和存活率均與人類AHF臨床接近。單獨采用D-GalN造模也有應用更高劑量的報道。Zhu等[9]給雄性Wistar大鼠(150±20)g腹腔注射2.5 g/kgGalN，連續3 d，驗血結果表明，谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、總膽紅素(TBIL)顯著升高，血清白蛋白(ALB)、膽堿酯酶(CHE)降低，表明建模成功。

應用D-GalN制備AHF模型已經比較成熟，但是所用劑量目前的文獻報道還有一定的差別。

1.2 硫代乙酰胺(TAA)

TAA是強烈的肝毒性藥物，給予動物后能造成肝小葉中心的壞死和損傷。體外研究也發現，TAA能夠誘導肝細胞凋亡。

與其他造模藥物不同，TAA構建的AHF模型會導致大鼠低血糖和電解質紊亂。首次注射TAA后，每12 h內需皮下注射10%的葡萄糖及林格氏液25 mL/kg[10]，或者是在大鼠日常飲用的水中添加5%的葡萄糖、0.45%的生理鹽水和0.149%的氯化鉀[11]。魏新智等[12]一次性腹腔注射不同劑量的TAA制作大鼠急性肝損傷模型，檢測AST、ALT及肝臟病理學變化。結果：TAA 200 mg/kg的劑量組血清ALT、AST值顯著升高，病理學檢查顯示肝細胞變性壞死，肝臟病理變化均一，雌性鼠的各項指標均不如雄性鼠明顯，給藥后24 h急性肝損傷最明顯。

腹腔注射TAA構建小鼠模型時劑量不統一，100 mg/kg[13]、200 mg/kg[14]、1 000 mg/kg等均有報道[15]，品種以C57BL/6j居多。選用18～22 g C57BL/6j小鼠腹腔注射TAA200 mg/kg，注射第3天比第1天，iNOS mRNA水平增加6.1倍，TNF-α mRNA 增加2.1倍[14]。

1.3 對乙酰氨基酚(APAP)

約25%的爆發性肝衰竭和近50%的肝功能異常與用藥有關，其中非甾體類解熱鎮痛藥APAP是引起急性肝衰竭并需肝移植的首要藥物。正因為如此，APAP也被用于制備AHF動物模型，APAP誘導的AHF的機制與蛋白結合、線粒體功能障礙、氧化應激有關[16]，其中線粒體功能障礙是對APAP導致AHF的最重要的機制之一：中毒劑量的APAP或其代謝產物可選擇性地失活三磷酸腺苷(ATP)酶復合體中的高親和力位點，抑制線粒體ATP酶活性，使ATP合成速率下降，并對線粒體超微結構造成顯著損傷。Rao等[13]用APAP和TAA兩種方法誘導小鼠，結果發現，APAP誘導的AHF對肝臟的損傷作用起效快，神經功能退化導致的肝性腦病在8～10 h后出現，而TAA誘導的模型中腦病90小時后才出現；APAP誘導的模型中血氨濃度增加7倍、血清增加60倍、AST增加10倍、水通道蛋白-4(AQP4)含量增加150%，而TAA誘導的模型中血氨濃度增加5倍、AST增加10倍、ALT增加13倍，AQP4蛋白含量增加85%。兩種實驗方法均證明AQP4蛋白與AHF的腦水腫癥狀有著決定性作用。

1.4 四氯化碳(CCl4)

CCl4是一種非極性的、具有揮發性的無色液體，可以導致急性肝損傷。由于灌胃給藥后經門靜脈吸收直接入肝，因此多采用此給藥方式。給大鼠口服CCl4后12～48 h，大鼠肝臟可出現典型的肝損傷病理變化，表現為彌漫性肝小葉中心帶中間帶肝細胞氣球樣變伴小葉中心管肝細胞胞漿凝聚，72 h后病變較輕，僅可見個別肝小葉中心散在單個細胞氣球樣變及小點狀炎細胞浸潤[17]。采用灌胃法給大鼠30%CCl4(4mL/kg)誘導大鼠AHF模型，造模24h后測定血中ALT、AST以及肝指數和胃勻漿中的胃蛋白酶等指標，結果表明模型組上述指標與正常組比較均有顯著提高[18]。

CCl4還能與D-GalN和LPS聯合應用制備小鼠慢加AHF模型，即先腹腔注射20%CCl4油溶液5 mL/kg，每周2次，連續注射12周，制備小鼠慢性肝損傷模型；在12周末次給藥3 d后腹腔聯合注射1 g/kgD-GalN和10 μg/kgLPS誘導AHF模型[19]。此外，CCl4還能用于制備肝性腦病模型[20]。

高濃度的CCl4對黏膜有輕度刺激，對中樞神經有麻醉作用，對肝腎有嚴重損傷，使用時需注意其可能對實驗者造成健康損害。也有報道認為CCl4誘導的肝衰造成的肝壞死不同于人的肝損傷[15]。

2 兔AHF模型

兔價格相對豬、犬等大型動物低廉，圍手術期管理相對簡單，是研究肝臟外科疾病的良好的動物模型。Hung等[21]改進了手術操作，摘除了新西蘭兔前面的三葉肝(占整個肝的74.12%)，結扎右外肝的肝蒂(占整個肝的20.22%)，只留下肝尾葉(占整個肝的5.67%)，與其他模型相比，該手術不需要分離肝門靜脈和體靜脈，容易操作和重復，該模型也適合用于測試生物人工肝支持系統在AHF的應用。

兔出血癥病毒(rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV)屬杯狀病毒科，能引起有生命危害的病毒性肝炎，能反映人類AHF的很多特征，如出血性素質、腦病、顱內高血壓。RHDV模型是兔特有的模型，也是構建兔AHF模型的常用方法。選用9周齡的新西蘭兔，肌內注射2×104紅血球凝聚單元RHDV，12 h以后，兔神經紊亂、癲癇、共濟失調、后軀麻痹，隨后衰竭、呼吸紊亂、心動過速，感染RHDV 24 h后血漿AST活性和總膽紅素濃度顯著增加，36 h后 ALT活性與對照組比顯著增加，48h后ALT、AST和TBIL值均達到最高值[22]。

曹友德等報道了一種結合了手術與藥物的兔急性肝衰竭模型的制備方法[23]：給兔一次性腹腔注射1g/kgD-GalN和100 μg/kg LPS，同時加用乳果糖，注射后2 h麻醉動物，在近肝門處結扎法切除肝左葉外緣、右葉外緣及尾葉前部共50%肝組織，平均手術時間(25～30) min。

3 豬AHF模型

3.1 藥物造模

APAP是一種常用的解熱鎮痛藥，過量可以引起肝小葉中央性壞死，因此被應用于制備AHF模型。但是，早期研究表明，APAP誘導的模型中豬生存時間相差很大，并且易發生致命的高鐵血紅蛋白血癥(methemoglobinemia)或急性貧血，并且在APAP給藥劑量、豬生存時間和血藥濃度之間缺乏相關性[24,25]。2011年，Thie等應用空腸給藥APAP，并且報道豬的生存時間差異變小，在急性肝衰模型制成后平均生存時間是21± 5 h[26]。Lee等[27]將APAP片混懸于30 mL水中，給藥于豬(30～40 kg，雌性)十二指腸中，起始劑量為0.25 g/kg，每小時給予維持劑量直至不可逆的急性肝衰發作(以凝血酶原時間超過60s為指標)。剛開始的維持劑量對于體重在38kg以下或以上的豬分別是3或3.5g/只，隨后根據情況在0.5～3.5 g范圍內調節。

將D-GalN溶于5%葡萄糖溶液中配成10%的溶液，并將pH調節到6.8，靜脈注射給藥于5～8月齡的豬(10±3)kg，劑量為0.3 g/kg，可以制備AHF模型[28]。也有報道采用8～10 kg的雄性實驗豬制備模型，D-GalN頸靜脈給藥劑量為1.5 g/kg[29]，說明給藥劑量還需要進一步的規范。有研究比較了不同劑量給藥后對豬AHF模型的影響，分3組給藥，劑量分別為0.5、1和 0.75 g/kg，觀察其臨床表現、生理生化指標和病理改變，結果表明，3組實驗都能引出與人的臨床和生化指標變化相近的肝功能衰竭的表現，并以0.75 g/kg組最為理想[30]。D-GalN在使用時要注意實驗人員的自我保護，給藥時要戴手套和一次性注射器，其他器械以大量清水沖洗。

3.2 外科手術模型

部分肝切除和急性肝缺血均可導致肝功能衰竭的發生。例如將門靜脈和下腔靜脈進行端側吻合，并且結扎肝動脈和膽管可以誘發爆發性肝衰[31]。最新的研究將兩者結合可以制備豬AHF模型:采用35～40 kg的豬作為模型動物，切除70%的肝實質并且封閉20 min肝總靜脈血流即可以導致肝衰的發生，手術后2 h可以進行實驗[32]。

4 犬AHF模型

4.1 藥物造模

黃建偉報道了一種應用藥物造模的方法[33]。取(13.3±1.18) kg的健康比格犬，雌雄各半，第一次靜脈注射30% APAP (0.5 mL/kg)，腹部皮下注射40% CCl4(0.5 mL/kg)，第12 h重復給藥，給藥途徑相同，給藥劑量為第一次給藥劑量的1/2，建立犬AHF模型。犬建模后24 h內死亡率為0，ALT和AST逐漸增加，在第24 h出現高峰;TBIL水平則在第6 h出現高峰，肉眼見肝臟充血腫大，暗紅色與白色相間，光鏡和電子顯微鏡示線粒體腫脹，粗面內質網明顯脫粒，細胞核萎縮等。該模型的優勢是與臨床上多見肝炎病毒及藥物中毒所致的AHF病理生理過程相似，且易于進行連續性監測和體外血液循環治療，故有望成為人工肝研究新的更理想的實驗動物模型。

Patzer等報道了應用D-GalN造模的方法，給犬靜脈注射1.5 g/kg可以制備AHF模型，平均生存時間43.7 h，血清生化檢查證實了模型的構建成功[34]。

4.2 外科手術模型

制備犬AHF模型的手術方法通常選用肝切除，例如切除80%肝組織造模[35]。陳鐘等[36]報道了另一種手術制備犬AHF模型的方法。采用一期門腔端-側分流、膽總管切斷結扎術制備模型，模型犬于術后血氨、ALT、堿性磷酸酶(ALT)和總膽紅素逐漸升高，凝血酶原時間延長，Fischer比(支鏈氨基酸/芳香氨基酸)下降，于2周時最為明顯，14 d后隨著時間延長，動物逐漸死亡。肝臟病理檢查顯示典型的淤膽、匯管區炎癥、肝細胞變性、壞死表現，提示模型制作成功。

5 結語

目前，制備AHF動物模型的方法主要是藥物造模和外科手術造模，對于大鼠、小鼠等小型動物而言，藥物造模是主要方法，對于豬、犬等動物而言，手術造模也占一定的比例。在藥物造模中，聯合用藥的比例在增加，而在手術造模中主要方法是通過肝缺血或肝切除來制備AHF模型。目前，也出現了結合藥物與手術造模的方法，模型制備效果較好。

在臨床病例中，急性病毒性肝炎是導致AHF的主要原因，約占病例的72%，此外，藥物肝損傷、中毒也是導致AHF的原因。因此，在臨床病例中，AHF病人往往早期已經有一定的肝功能不全，對于AHF動物模型構建而言，慢加AHF模型更能模擬臨床的發病特征，但是這種模型往往構建周期較長，限制了其推廣應用。

[1] Silverstein R.D-galactosamine lethality model: scope and limitations[J]. Endotoxin Res,2004, 10:147-162.

[2] Kitazawa T, TsujimotoT, KawarataniH, et al. Salvage effect of E5564, Toll-like receptor 4 antagonist on d-galactosamine and lipopolysaccharide-induced acute liver failure in rats[J].J Gcstroenterol Hepatol, 2010,25:1009-1012.

[3] 楊昊臻,陳瓏,童晶晶,等.D-半乳糖胺/脂多糖所致小鼠急性肝衰竭模型正交試驗優化研究[J].中華肝臟病雜志,2013,21(6):464-466.

[4] Lin X,Zhang S, Huang R,et al. Protective effect of genistein on lipopolysaccharide/D-galactosamine-induced hepatic failure in mice[J].Biol Pharm Bull,2014, 37(4): 625-632.

[5] 黃紹芳,吳飛,劉衛,等.重組血栓調節蛋白N端結構域和可溶性晚期糖化終末產物受體對急性肝衰竭模型鼠的保護作用[J].中華肝臟病雜志,2013,21(10):761.

[6] 潘慶軍,朱學芝,劉淵.LPS /D-GalN誘發NF-κB 轉基因小鼠急性致死性肝損傷模型的建立[J]. 中國實驗動物學報,2013,21(4):1-5.

[7] 劉芳,陳少紅,范新娟,等.急性肝衰竭模型構建及細胞移植途徑初探[J].南華大學學報(醫學報),2006,34(4):482-486.

[8] Zhang L, Kang W, Lei Y,et al.Granulocyte colony-stimulating factor treatment ameliorates liver injury and improves survival in rats with d-galactosamine-induced acute liver failure[J].Toxicol Lett,2011, 204(1):92-99.

[9] ZhuH，Zhang Y, Hu X,etal.The effects of high-dose qingganhuoxue recipe on acute liver failure induced by D-galactosamine in rats[J].Evid-Based Compl Alt Med,2013,Article ID 905715.

[10] Ching CC, Sun SW,Hui CH,et al. Selective cyclooxygenase inhibition improves hepatic encephalopathy in fulminant hepatic failure of rat[J].EurJ Pharmacol,2011, 666(1-3):226-232.

[11] Sathyasaikumar K, Swapna I, Reddy P, et al. Co-administration of C-phycocyanin ameliorates hioacetamide induced hepatic encephalopathy in Wistar rats [J]. J Neurol Sci 2007,252: 67-75.

[12] 魏新智,付強勇,王琿,等.硫代乙酰胺建立大鼠急性肝損傷模型探討[J].臨床醫學工程,2009,6(5):48-49.

[13] Rao KVR, Verkman AS, Curtis KM, et al. Aquaporin-4 deletion in mice reduces encephalopathy and brain edema in experimental acute liver failure[J].Neurobiol Dis,2013, 63:222-228.

[14] Wang CH, Chen YJ, Lee TH,etal.Protective effect of MDL28170 against thioacetamide-induced acute liver failure in mice[J].Biomed Sci, 2004,11:571-578.

[15] Li WW, Wei YH, Li H, et al. Isolation and characterization of a novel strain of mesenchymal stem cells from mouse umbilical cord:potential application in cell-based therapy[J]. Plos ONE,2013, DOI: 10.1371/journal.pone.0074478.

[16] McGill MR, Li F, Sharpe MR,et al. Circulating acylcarnitines as biomarkers of mitochondrial dysfunction after acetaminophen overdose in mice and humans[J].Arch Toxicol, 2014, 88(2):391-401.

[17] 童英,閆向東,高珊,等.四氯化碳急性肝損傷敏感指標的研究[J].中國食品衛生雜志,2000,12(6):10-12.

[18] 王歡,烏恩其.蒙藥祛“熱”涼性方劑給旺-9對四氯化碳誘導大鼠急性肝衰竭的影響[J].中國實驗方劑學雜志,2013,19(8):238-241.

[19] 張慧蕓,婁金麗,李寧.四氯化碳聯合D-氨基半乳糖、脂多糖誘導慢加急性肝衰竭模型的建立[J].北京醫學,2011,33(3):199-202.

[20] 劉冀,朱建忠,隋月林,等.四氯化碳誘導大鼠肝性腦病模型的建立[J].中國比較醫學雜志,2012,22(2):33-37.

[21] Huang KC, Yong CC, Chen YS, et al. A surgical model of fulminant hepatic failure in rabbits[J].Liver Inter,2007, 27(10):1333-1341.

[22] Lastra RC, MiguelBS,Crespo I,et al.Signaling pathways involved in liver injury and regeneration in rabbit hemorrhagic disease,an animal model of virally-induced fulminant hepatic failure[J].Vet Res,2010,41:02.

[23] 曹友德,梁珊,李灼日,等.兔不同急性肝衰竭模型的建立與評價[J].現代生物醫學進展,2009,9(5):846-848.

[24] Miller DJ, Hickman R, Fratter R, et al. An animal model of fulminant hepatic failure: a feasibility study [J]. Gastroenterology ,1976, 71:109-113.

[25] Henne-Bruns D, Artwohl J, Broelsch C, et al. Acetaminophen-induced acute hepatic failure in pigs: controversial results to other animal models [J]. Res Exp Med (Berl), 1988,188:463-472.

[26] Thiel C, Thiel K, Etspueler A, et al. A reproducible porcine model of acute liver failure induced by intrajejunal acetaminophen administration.Eur Surg Res, 2011,46:118-126.

[27] Lee KC, Palacios JC, Alibhai H, et al. A reproducible, clinically relevant, intensively managed, pig model of acute liver failure for testing of therapies aimed to prolong survival [J]. Liver Int, 2013,33 (4): 544-551.

[28] Xiao JQ, Shi XL, Ma HC, et al. Administration of IL-1Ra chitosan nanoparticles enhances the therapeutic efficacy of mesenchymal stem cell transplantation in acute liver failure [J]. Arch Med Res, 2013,44(5):370-379.

[29] Li J, Zhang L, Xin J, et al. Immediate intraportal transplantation of human bone marrow mesenchymal stem cells prevents death from fulminant hepatic failure in pigs [J].Hepatology, 2012, 56(3):1044-1052.

[30] 陳影波,何永源,杜原贊,等.急性肝功能衰竭的豬動物模型[J].暨南大學學報(自然科學與醫學版)，2000,21(6):22-25.

[31] Detry O, Janssen N, Cheramy-Bien JP, et al. Effects of large-pore hemofiltration in a swine model of fulminant hepatic failure [J]. Artif Organs 2012, 36(11):981-987.

[32] Prazak J, Laszikova E, Pantoflicek T, et al. Cerebral microdialysis reflects the neuroprotective effect of fractionated plasma separation and adsorption in acute liver failure better and earlier than intracranial pressure: a controlled study in pigs [J]. BMC Gastroenterol, 2013, 13:98.

[33] 黃建偉.四氯化碳構建犬急性肝衰竭模型及血液凈化效果探討[D].暨南大學碩士研究生論文,2010.

[34] Patzer JF, Block GD, Khanna A, et al. D-galactosamine based canine acute liver failure model [J]. Heaptob Pancreat Dis Int, 2002, 1(3):354-367.

[35] Chen XP, Xue YL, Li XJ, et al. Experimental research on TECA-I bioartificial liver support system to treat canines with acute liver failure[J]. World J Gastroenterol, 2001, 7(5):706-709.

[36] 陳鐘,丁義濤,徐慶祥,等.犬急性肝衰竭一種新模型的建立[J].中國普通外科雜志,2003,12(3):206-209.

Recent advances in research on animal models of acute hepatic failure

QU Ye-qing

(Animal Laboratory Center, the Affiliated Drum Tower Hospital,Medical School of Nanjing University,Jiangsu Nanjing 210008, China)

Acute hepatic failure (AHF) is a severe liver disease associated with a variety of clinical symptoms. AHF is difficult to treat and with a high mortality rate. Therefore, it is necessary to establish animal models of AHF for the investigation of therapy. In this article, the preparation methods of AHF animal models are reviewed which are applicable to different types of animals.

Acute hepatic failure; Animal models

瞿葉清(1980-)，女，獸醫師，從事動物實驗管理及動物實驗工作。E-mail: quyeqing1980@163.com。

R33

A

1671-7856(2014) 08-0057-05

10.3969.j.issn.1671.7856. 2014.008.013

2014-05-07