葛根通脈飲誘導血管平滑肌細胞凋亡的實驗研究

陳 芳郜新蓮* 沈曉君趙君玫

（1 河南省人民醫院，河南 鄭州 450003；2 河南中醫學院，河南 鄭州 450008）

葛根通脈飲誘導血管平滑肌細胞凋亡的實驗研究

陳 芳1郜新蓮2* 沈曉君2趙君玫2

（1 河南省人民醫院，河南 鄭州 450003；2 河南中醫學院，河南 鄭州 450008）

目的研究葛根通脈飲對同型半胱氨酸（homocysteinemia，HCY）誘導增殖大鼠血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）的促凋亡作用。方法制備葛根通脈飲含藥血清，大鼠VSMC原代培養、鑒定，分為空白組、HCY組、葛根通脈飲組、瑞舒伐他汀（可定）組、葛根通脈飲聯合可定組。藥物干預后，Annexin/PI雙染法檢測細胞凋亡率。結果與空白組比較，HCY組細胞凋亡率顯著降低（P＜0.01）；與HCY組比較，葛根通脈飲組、可定組、葛根通脈飲聯合可定組細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。結論葛根通脈飲可促進HCY誘導增殖的大鼠VSMC凋亡，可能是其抗動脈粥樣硬化（atherosclerosis， AS）作用機制之一。

葛根通脈飲；同型半胱氨酸；血管平滑肌細胞；細胞凋亡

血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）過度增殖是動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）形成的主要病理機制之一，抑制VSMC增殖是防止AS病變發生發展、減輕血管重構的的關鍵[1]。本實驗通過觀察我院的院內制劑葛根通脈飲對同型半胱氨酸（homocysteinemia，HCY）誘導增殖大鼠VSMC的促凋亡作用，探討其抗動脈粥樣硬化的機制，為葛根通脈飲臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 葛根通脈飲和瑞舒伐他汀（可定）含藥血清制備

葛根通脈飲由葛根30 g、山楂15 g、太子參12 g、當歸尾6 g、淫羊藿6 g、赤芍6 g、川芎6 g、甘草6 g等組成，藥材購自河南中醫學院第一附屬醫院中藥房并由制劑室制備成中藥湯劑。瑞舒伐他汀（可定），阿斯利康制藥有限公司，國A2002002。新西蘭大白兔給藥劑量為臨床用藥劑量的5倍，每日劑量分2次灌胃，連續5 d，末次給藥后1 h，腹主動脈取血，離心、分離備用。

1.1.2 主要儀器與試劑

CO2恒溫培養箱（德國Heraeus公司）；FACS Calibur 流式細胞儀（BD.USA公司產品）；FLUOVIEW FV100共聚焦熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；DMEM、胰蛋白酶（Gibco BRL. USA產品）；Ⅱ型膠原酶 （Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）；α-SMA抗體（武漢博士德公司產品）；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物公司產品）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠VSMC原代培養

雄性wistar大鼠，體質量200～250 g，購自湖北省動物實驗中心。戊巴比妥鈉腹腔麻醉后迅速分離、取出腹主動脈，小心剝除血管外膜，縱行剪開血管。PBS洗兩次，剪成0.5～2 mm大小的組織塊，放入含有1 mg/mLⅡ型膠原酶溶液的離心管中，37 ℃溫箱中消化30 min。劇烈震蕩離心管，除去內皮細胞，將取出的組織塊放入1 mg/mL II型膠原酶溶液中，37 ℃溫箱中消化4～6 h，待組織塊呈絮狀后終止消化。離心，去上清，重懸細胞，轉入培養瓶中。待細胞長至75%匯合度時，消化傳代，取2～5代細胞用于實驗。

1.2.2 原代培養的大鼠VSMC免疫組織化學檢測

細胞接種到6孔板中，培養72 h，去上清，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，加入0.3%TritonX-100，倒掉后再加入TritonX-100室溫透化15 min，滴加30 μL血清封閉液（二抗宿主來源），室溫封閉30 min。加入一抗α-SMA抗體（1∶50），4 ℃孵育過夜。加入FITC標記羊抗小鼠二抗（1∶100），37 ℃孵育30 min，同時加4’，6二脒基-2-苯吲哚鹽酸（4’，6-diamino-2-phenylindole，DAPI）染細胞核，37 ℃孵育30 min，封片后熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 細胞分組與藥物干預

取生長狀態良好的細胞胰酶消化，制備細胞懸液，調整細胞濃度為1×106/mL。將處理好的蓋玻片放入6孔板各孔中，每孔準確接種900 μL細胞懸液，繼續培養后將細胞分為空白組、HCY組、葛根通脈飲組、瑞舒伐他汀（可定）組、葛根通脈飲聯合可定組。除空白組外，各組均加入劑量為10-4mol/L同型半胱氨酸，培養24 h后，葛根通脈飲組加入葛根通脈飲含藥血清，可定組加入可定含藥血清，葛根通脈飲聯合可定組同時加入葛根通脈飲、可定含藥血清，培養48 h后，收集細胞。

1.2.4 Annexin V-PI法檢測細胞凋亡率

各組細胞用PBS洗滌，0.125%胰蛋白酶消化，轉移至離心管，加培養液，混勻，1000 r/min離心，棄上清，加PBS，重懸細胞，調整細胞濃度為106/mL，取0.5 mL細胞懸液，1000 r/min離心4 min，棄上清，加0.5 mL Binding Buffer，重懸細胞，加1 μL熒光標記的annexin V試劑，混勻，室溫下避光孵育20 min，加入PI 5 μL，混勻后4 ℃下避光孵育5 min，加入Binding Buffer 500 μL，隨即用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率，用Flow max 2.4軟件進行數據處理。

1.2.5 數據統計與分析

各組細胞測定值以均數±標準差（xˉ±s）表示，使用SPSS10. 0軟件包進行單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。

2 結 果

2.1 原代培養的大鼠VSMC形態及免疫組織化學檢測結果

倒置相差顯微鏡觀察，培養的細胞多數呈長梭形，核大，細胞核呈藍色，細胞質呈現綠色，可見明顯的肌絲纖維。免疫組化結果顯示，細胞胞質內特異性標志蛋白α-SMA表達呈陽性者超過98%的，提示培養細胞為VSMC。

2.2 Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞儀檢測結果

與空白組（4.36±0.25）比較，HCY組（1.17±0.15）細胞凋亡率顯著降低（P＜0.01），提示HCY可誘導VSMC增殖；葛根通脈飲、可定均可顯著促進VSMC凋亡，葛根通脈飲組（3.08±0.14）、可定組（2.35 ±0.24）、葛根通脈飲聯合可定組（3.23±0.22）大鼠VSMC凋亡百分率與HCY組相比較，差異均有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。

3 討 論

AS及其所致的冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、腦卒中是目前世界范圍內兩大主要死亡原因[2]。研究證實，AS的主要病理形態學特征之一是VSMC向動脈內膜的遷移和增殖。脂質代謝紊亂、高HCY血癥等AS危險因素可損傷血管內皮細胞，引起血小板和單核巨噬細胞黏附、聚集，血小板釋放的細胞因子促使VSMC遷移至血管內膜，在內膜增殖后，VSMC和巨噬細胞荷脂形成泡沫細胞，VSMC還可合成膠原纖維等基質，進而形成AS斑塊，因此，抑制VSMC遷移和增殖，對于延緩或阻止AS病變發生發展及心血管病防治具有重大意義[3]。

我們的前期研究發現[4-6]，作為單體的葛根素具有保護血管內皮細胞，調節血脂水平，抑制VSMC增殖等良好的抗AS作用，葛根素預防性給藥能明顯抑制兔主動脈AS病變，其機制與調控細胞周期、影響內質網應激水平、抑制AS過程中炎性反應等密切相關。在前期工作的基礎上，根據臨證經驗，我們以葛根為主藥，將葛根通脈飲方劑應用于臨床，治療AS及其所致心腦血管疾病。方中葛根升陽解痙，通利血脈為君；赤芍、川芎行血活血，山楂活血散瘀、化痰行氣，共助葛根散瘀通脈為臣；淫羊藿、太子參升提脾腎之陽氣，當歸補血養血，三藥同用，達氣帥血行，通而不滯之功，為佐藥；炙甘草補中益氣，固護脾胃，調和諸藥為使。本實驗中，葛根通脈飲組和葛根通脈飲聯合可定組大鼠VSMC凋亡百分率顯著高于HCY組，提示葛根通脈飲可顯著促進VSMC凋亡，可能是其抗AS作用機制之一。

[1] Ghatak SB,Dhamecha PS,Bhadada SV,et al.Investigation of the potential effects of metformin on atherothrombotic risk factors in hyperlipidemic rats[J].Eur J Pharmacol,2011, 659(2/3):213-223.

[2] Hansson GK,Hermansson A.The immune system in atherosclerosis[J].Nat Immunol,2011,12(3):204-212.

[3] 李桂源.病理生理學[M].北京:人民衛生出版社,2011:341-350.

[4] 沈曉君,魏群,陳芳,等.葛根素誘導血管平滑肌凋亡的細胞周期調控機制研究[J].新中醫,2011,43(2):139-141

[5] 魏群,陳芳,沈曉君,等.葛根素對兔動脈粥樣硬化炎性因子的影響[J].中國老年學雜志,2011,31(18):3541-3543.

[6] 沈曉君,魏群,陳芳,等.葛根素對血管平滑肌細胞周期相關蛋白表達的影響[J].中國中醫基礎醫學雜志,2011,17(1):69-70.

R285.5

B

1671-8194（2014）24-0069-02

河南省教育廳科學技術研究重點項目（13A310612）

*通訊作者：E-mail：shenxiaojun0628@163.com