腸肌成纖維細胞與IBD相關腸纖維化*

宋 佳，張曉嵐

腸纖維化是炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)的并發癥，其主要病理表現為以膠原為主的細胞外間質(extracellular matrix，ECM)在腸組織的過度合成和異常沉積。其中，潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)以直腸和結腸的淺表性炎癥病變為主，其腸纖維化一般只限于粘膜下層;而克羅恩病(Crohn disease，CD)則是以全腸道均可受累的透壁性炎癥為特征，導致腸壁各解剖層均發生ECM異常沉積，最終形成腸道狹窄、發生腸梗阻［1-3］，嚴重影響著患者生活質量。

腸纖維化的主要效應細胞是腸肌成纖維細胞。在炎癥初期，大量腸成纖維細胞的出現是損傷愈合的征象，其活化轉變為肌成纖維細胞導致自身過度增殖，分泌大量以膠原為主的ECM和細胞因子，被認為是腸纖維化發生、發展的中心環節。本文就腸肌成纖維細胞的生物學特征、腸肌成纖維細胞的分化、其在IBD相關腸纖維化發生中的作用做一綜述。

1 腸肌成纖維細胞的生物學特征

肌成纖維細胞于人類胚胎的第21周出現，小鼠胚胎的第18.5天出現［4］。腸肌成纖維細胞主要包括 Cajal間質細胞(interstitial cells of Cajal，ICC)和腸上皮下肌成纖維細胞(intestinal subepithelial myofibroblast，ISEMF)。ICC定位于腸組織的粘膜下層、粘膜固有層和肌層，其主要功能是作為胃腸平滑肌蠕動的起搏器，促進電信號活動和傳播，調節神經傳遞、免疫調節、組織修復及纖維化。ISEMF定位于腸粘膜固有層，其主要功能是參與粘膜的生長和發育，保護和促進傷口愈合、纖維化，免疫與炎癥，水和電解質運輸。電鏡下，腸肌成纖維細胞成梭形或星狀，其細胞膜成小凹狀，細胞含大量的胞質和細胞周基質，內部有大量可以產生膠原顆粒的粗面內質網和高爾基體。Bard等研究顯示固有層肌成纖維細胞和血管周平滑肌細胞來自絨毛膜中皮層。腸肌成纖維細胞之間通過縫隙連接和包含鈣粘蛋白的特異性緊密連接相聯系，并通過纖維連接和非基膜結構與周圍基質聯系。腸肌成纖維細胞所表達的平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和波形蛋白(vimentin)呈陽性、平滑肌肌球蛋白呈陰性，平滑肌肌球蛋白和纖維連接蛋白表達呈陽性、結蛋白(desmin)呈弱陽性或陰性。另外，腸肌成纖維細胞還有一些非典型的標志分子，如胸腺細胞分化抗原(the thymus cell differentiation antigen，Thy)-1、成纖維細胞特異蛋白(fibroblasts special proteins，FSP)-1、黑色素瘤軟骨素硫酸蛋白多糖(melanoma cartilage element sulfuric acid protein polysaccharide，MCSP)、成纖維細胞活化蛋白(fibroblast activation protein，FAP)等。

2 腸肌成纖維細胞的分化

炎癥和損傷時多種細胞可向腸肌成纖維細胞轉化，其中，靜息的成纖維細胞或星狀細胞的活化、血管周平滑肌細胞轉化、上皮細胞向間質細胞轉化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)、內皮細胞向間質細胞轉化(endothelial to mesenchymal transition，EnoMT)及骨髓來源的干細胞轉化(CD14+單核細胞轉化為循環的CD34+纖維細胞，再變為靜息的CD34+纖維細胞)是其轉化的幾種主要方式。肌成纖維細胞通過各種機制而活化，包括免疫和非免疫細胞的旁分泌途徑、肌成纖維細胞的自分泌途徑、微生物與Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)等識別受體途徑，如結合產生的病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)［5］。調節腸肌成纖維細胞活化的主要可溶性因子包括:生長因子，如轉化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF β1)、結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)、血小板衍化生長因子 I(platelet derived growth factor，PDGF)、胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor，IGF-Ⅰ)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)等;細胞因子，如白細胞介素(interleukin，IL)-1、IL-13、IL-17、IL-23、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α等;趨化因子，如單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)、巨噬細胞炎癥蛋白1(macrophage inflammatory protein 1，MIP-1)等;血管因子如血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、腎素血管緊張素系統(renin-angiotensin system，RAS)的成分。

2.1 PAMPs 腸道細菌表達PAMPs(脂多糖、細菌DNA、雙鏈RNA)，它能與免疫細胞和非免疫細胞外的TLRs結合，從而介導MyD88依賴性或非依賴性信號途徑。研究證實 TLR2、3、4、6、7在 CD 患者分離的腸成纖維細胞表達增加，它們通過各自的細菌配體抗原激活，促進成纖維細胞向肌成纖維細胞分化。另外，暴露于TLR配體的人類腸肌成纖維細胞的纖維蛋白表達增加、α-SMA表達上調。因此，PAMPs-TLRs途徑是腸肌成纖維細胞活化的機制之一。

2.2 TGF-β1/果蠅反向同源序列(drosophila mothers against decapentaplegic，Smad) TGF-β 是存在于所有細胞中的多功能多肽激素。TGF-β1的促增殖作用包括促進ECM細胞的聚集和活化、EMT和EndoMT。TGF-β1與其受體1結合，磷酸化特異性受體活化Smad(Smad2和Smad3)，與中介體Smad(Smad4)形成復合物。Smad2或3/Smad4復合物通過胞漿輸入蛋白轉至核內，可作為轉錄因子直接結合DNA或與DNA結合蛋白連接。另一類Smad蛋白為抑制性Smads，如 Smad6或 Smad7，通過干擾 Smad2/3結合為活化的受體復合物拮抗TGF-β1信號轉導途徑。

通過cDNA微陣列/啟動子反式活化方法，一些新Smad基因靶點被識別，包括I型膠原(collagen type I，Col1)A1、Col3Α1、Col5A2、Col6A1、Col6A3 和基質金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase I，TIMP-1)，暗示Smad信號途徑在一些纖維狀膠原基因的活化中起重要作用。大約還有60個ECM相關基因也被識別，介導早期下調TGF-β基因靶點。

Brenmoehl等［6］研究顯示 TGF-β1干預原代人結腸成纖維細胞后α-SMA和纖維連接蛋白表達增加，表明TGF-β1誘導腸成纖維細胞活化。通過對TGF-β1過表達小鼠模型的研究發現，大量的腸成纖維細胞在腸道聚集，腸壁增厚，這可能是TGF-β1直接的作用，也可能是其與CTGF、PDGF和IGF-1的協同作用。發生腸梗阻的CD患者腸組織中TGF-β1和CTGF轉錄水平上調支持了TGF-β1的間接作用［7］。提示TGF-β1與其它細胞因子的協同作用是促進腸成纖維細胞向腸肌成纖維細胞轉化并發生增殖上調的決定性因素。

2.3 CTGF、PDGF、IGFs CTGF是富含半胱氨酸促有絲分裂多肽，由TGF-β活化的成纖維細胞分泌。其包含兩個結構域，C端的肝素結合結構域對成纖維細胞的增殖和黏附起了重要作用，N端的生長因子結合結構域主要調節肌成纖維細胞的分化和膠原的合成。在成年哺乳動物中，CTGF作為TGF-β的下調因子作用于結締組織，刺激成纖維細胞增殖。TGF-β的生物活性復雜，CTGF可能作為更特異性的靶點選擇性干預腸纖維化中結締組織形成的過程。PDGF由2條二硫鍵連接的相關肽鏈組成，主要由巨核細胞生成。內皮細胞、成纖維細胞等細胞也合成PDGF。在PDGF家族，主要是PDGF-Ⅱ刺激腸成纖維細胞激活和增殖［8］。IGFs(IGF-Ⅰ和-Ⅱ)分別是由70和67個氨基酸單鏈組成的多肽。IGF-Ⅰ主要是出生后的胰島素因子。研究顯示在腸組織中，IGF-Ⅰ以自分泌形式作用于腸間質細胞，調節這些細胞的增殖。

2.4 RAS RAS成分在成人結腸組織都有表達。在結腸的許多細胞，如上皮細胞、血管內皮細胞、間質細胞和炎細胞均表達血管緊張素Ⅱ受體。小鼠、大鼠的實驗性結腸炎模型的結腸的血管緊張素Ⅱ表達增加支持了RAS在腸炎及其纖維化中對腸肌成纖維細胞的活化作用［9］。對三硝基苯磺酸(2，4，6-trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS)誘導小鼠結腸炎模型研究發現，血管緊張素肽原基因缺陷小鼠的急性結腸炎較野生型小鼠的結腸炎發病程度輕［10］。研究顯示，血管緊張素Ⅱ和TGF-β1在發生纖維化和狹窄的腸組織中過表達，尤其是CD。局部血管緊張素Ⅱ活化明顯刺激TGF-β1的產生。研究表明，低鹽飲食和非致命的輻射上調了腸隱窩周圍的肌成纖維細胞α-SMA的表達，卡托普利可以抑制這個過程。

2.5 IL-1和IL-33 IL-1作為促炎因子家族成員之一隨著組織損傷表達而增加。除了在急慢性炎癥中的作用，IL-1參與炎癥后的組織重塑。IL-1通過各種機制導致慢性腸炎相關纖維化形成，如調節腸肌成纖維細胞活化，誘導趨化因子IL-8、MCP-1和基質金屬膠原酶(matrix metalloproteinase，MMP)分泌。而且，IL-1聯合TNF和干擾素γ(interferon γ，IFN-γ)能增加TGF-β誘導的EMT。

最新研究表明，IL-33，一種新的IL-1家族成員，促進潛在的Th2反應，誘導黏膜炎癥，導致纖維化和血管化生［11-13］。其主要來源之一是腸上皮下肌成纖維細胞，與其激活子TLR-3結合進而活化肌成纖維細胞和血管周平滑肌細胞。

2.6 TNF-α TNF-α在CD和UC患者的腸組織大量表達。TNF-α能促進腸肌成纖維細胞有絲分裂和擴大炎癥部位，因此增強其它炎癥介導因子的表達，如IL-1β和IL-6，活化NF-κB信號轉導通路，增加細胞因子、酶、黏附因子表達的信號轉導通路。研究表明腫瘤壞死因子受體2(tumor necrosis factor recepter 2，TNFR 2)對TNF-α誘導肌成纖維細胞增殖和膠原沉積是必需的。另外，TNF-α能夠誘導TIMP-1表達并降低MMP-2活性和減少膠原分解。而且，TNF-α能夠協同IGF-Ⅰ刺激腸肌成纖維細胞增殖和膠原產生。

2.7 IL-4和IL-13 Th2因子如IL-4和 IL-13在纖維化過程中表達增加，誘導成纖維細胞活化和增殖為肌成纖維細胞，導致膠原生成。在TNBS結腸炎模型中，纖維化形成依賴于IL-13與其受體結合誘導TGF-β產生。同樣，IL-13信號通路被抑制，TGF-β產生減少，纖維化則不再發生。可溶IL-13Rα2-Fc是IL-13的高度有效的誘騙受體，能減輕已建立的纖維化疾病的發展。IL-4和IL-13似乎促進CD14+外周血單核細胞向纖維細胞分化，但不誘導其增殖。

2.8 IL-17和IL-23 研究表明使用P40肽鏈疫苗靶向IL-23可改善TNBS誘導的急慢性小鼠結腸炎的膠原沉積。IL-17被發現是腸間質細胞的潛在激活劑，尤其是肌成纖維細胞。IL-17通過 NF-κB和MAPK途徑活化刺激ISEMF分泌IL-6、IL-8和MCP-1。IL-17協同IL-1β或TNF-α提高ISEMF的分泌，尤其是IL-17協同TNF-α刺激IL-6分泌明顯升高。

在與炎癥細胞如嗜酸性細胞、肥大細胞和T細胞直接聯系中，腸成纖維細胞也活化增殖［14-15］。除了活化增殖，腸成纖維細胞可在炎癥介質的趨化作用下遷移至受損組織。IBD粘膜存在誘導腸成纖維細胞遷移的分子，包括纖維連接蛋白(被認為是最具潛能的趨化因子)、PDGF、IGF-1、EGF 和 TGF-β1。最近研究表明前列腺素E2通過其受體EP3或EP2/4分別直接或間接促進腸成纖維細胞的遷移［16］。TNF-α和IFN-γ能在體外減少腸成纖維細胞的遷移，可能導致腸成纖維細胞停留在體內的炎癥部位。

3 腸肌成纖維細胞在IBD相關腸纖維化中的作用

3.1 腸肌成纖維細胞介導腸道免疫反應 IBD動物模型的研究不僅已證明腸成纖維細胞表面存在的TLRs在其活化中的作用，也揭示了病原介導腸成纖維細胞活化和纖維化進程的緊密關系。腸粘膜免疫反應除了上皮細胞屏障腸道抗原及免疫細胞(如巨噬細胞、樹突細胞)與遺漏的腸道抗原發生免疫反應外，非免疫細胞(如成纖維細胞、內皮細胞)也可參與腸道免疫反應，即TLRs組成的固有免疫反應。人類CD90+腸肌成纖維細胞和成纖維細胞表達TLRs，發揮APCs的作用。它們的數量是固有層單核數量的30%。腸成纖維細胞和肌成纖維細胞的TLR4結合配體后上調了促炎因子和黏附分子，如細胞內黏附分子-1的表達，導致專職免疫細胞如淋巴細胞、巨噬細胞、中性粒細胞的招募，從而導致炎癥后纖維化。Bdora等［17］研究揭示，與人類成熟腸成纖維細胞相比，人類胎兒腸肌成纖維細胞對脂多糖反應性更高，通過TLR4途徑介導IL-8分泌。腸肌成纖維細胞的TLR活化還誘導CXC趨化因子8的分泌增加，進而促進血管化生導致腸纖維化形成。

3.2 腸肌成纖維細胞增強炎癥細胞的免疫調節作用 人類結腸上皮下肌成纖維細胞(subepithelial myofibroblast，SEMF)在IL-1β和 TNF-α誘導下表達IL-23 p19亞單位，其能活化巨噬細胞。IL-12和 IL-23通過 IL-12p40鏈與IL-12β1亞單位結合，分別促使Th1細胞和Th17細胞轉化。IL-23聯合抗IL-4和抗IFN-γ是最具潛能的促進Th17細胞產生。由腸成纖維細胞產生的TGF-β啟動先天CD4+T細胞向Th17細胞轉化［18］。IL-23缺乏時 TGF-β 誘導 Th17細胞增殖。人類結腸SEMF在IL-1β和TNF-α誘導下表達IL-32α，IL-32α 誘導NF-κB 活化，從而產生促炎因子［19］。Irina等［20］研究表明人類結腸肌成纖維細胞在IL-2存在下促進CD4+CD25highFoxp3+的Treg細胞增殖，維持腸道黏膜免疫耐受。有研究顯示成纖維細胞在炎癥微環境中過度增殖導致炎癥不能及時消退，是炎癥慢性化的關鍵環節。

3.3 腸肌成纖維細胞促進腸纖維化發生 腸肌成纖維細胞合成的細胞因子和ECM構成了IBD相關腸纖維化的重要因素。腸肌成纖維細胞分泌的促纖維化的細胞因子包括 TGF-β1、CTGF、IGF-Ⅰ等。體內外實驗均證實發生纖維化的腸組織TGF-β1表達較正常腸組織顯著增高，其持續過度表達導致腸道中ECM的積聚、重塑。腸壁粘膜的TGF-β1不僅可以直接刺激粘膜層、粘膜下層、固有層間質細胞的纖維連接蛋白(fibronectin，FN)、I、III、IV 等多型膠原的mRNA表達增高，而且刺激腸間質細胞過度表達粘附分子及血管內皮生長因子、CTGF等促纖維化因子。在膠原大量合成時TGF-β1抑制ECM降解酶，即MMP和纖溶酶原蛋白酶的活性，通過刺激TIMP的產生而抑制MMP的表達。Medina等［21］研究顯示TGF-β1上調了大鼠腸粘膜層肌成纖維細胞TGF-β1受體激活素受體樣激酶5、TIMP-1和Col1的表達。CTGF在CD纖維化腸壁組織中有很高的特異性表達。研究顯示，CD腸組織樣本與正常對照組比較，89%CD患者CTGF mRNA表達是正常組5倍以上。CTGF能夠上調 TGF-β1的生物活性、增加ECM聚集、促進組織纖維化效應，CTGF的存在可提高低濃度TGF-β1與其受體的結合力，提升 TGF-β1的促纖維化效應。亦有研究顯示IGF-Ⅰ與膠原沉積和纖維化相關。在實驗性腸纖維化動物模型和CD患者的腸組織中IGF-Ⅰ表達上調;在大鼠實驗性腸炎模型中，IGF結合蛋白(IGF binding proteins，IGFBPs)和膠原表達上調，膠原酶表達下調，表明IGF-Ⅰ在IGFBPs介導下，在腸炎膠原合成中的重要作用。在腸壁炎癥致纖維化形成過程中，TGF-β1還可上調IGF-Ⅰ mRNA的表達，TGF-β1和 IGF-Ⅰ是序貫、而非同時起作用的。ECM過度沉積是腸纖維化和梗阻形成的先決條件，但這種聚集不是純粹的被動的過程。事實上，ECM可發送調節信號給免疫和非免疫細胞，它是主動的內源性腸炎的誘導劑。例如，粘多糖透明質酸(hyaluronic acid，HA)介導這種獨特功能。在生理條件下，透明質酸為大分子聚合物，但炎癥時這種大分子結構裂解為小分子片段，小分子片段結合并活化TLR2和TLR4誘導固有免疫。HA可能也直接影響纖維化過程。大量研究表明大分子HA抑制腸成纖維細胞遷移和增殖，然而小片段HA通過重構細胞和促進血管化促進傷口愈合［22］。HA片段可能也促進腸成纖維細胞釋放細胞因子。文獻報道等［23-27］的研究定義了纖維化和傷口愈合是個階段的過程，表明HA對TGF-β1誘導腸肌成纖維細胞分化是必需的，是纖維化的早期階段。同樣，層粘連蛋白、IV型膠原、纖維蛋白片段也能調節腸肌成纖維細胞遷移和增殖。而且，ECM能固定、儲存和釋放細胞因子和趨化因子。TNF-α結合纖連蛋白和層粘連蛋白，堿性成纖維細胞生長因子和TGF-β1與各種其它ECM相互結合。

4 小結

腸肌成纖維細胞是IBD相關腸纖維化形成的關鍵細胞，通過其合成的ECM及細胞因子，構成了腸纖維化的基本要素，同時，IBD的病理狀態也為腸肌成纖維細胞的活化提供了必要條件。另外，腸肌成纖維細胞也促進了炎癥細胞的生物學功能，它們間的相互作用復雜，有待進一步研究，從而為IBD及其相關腸纖維化的發生、發展提供新思路。

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