大腸癌凋亡抑制蛋白表達與奧沙利鉑化療敏感性的相關性

馬廣友 李俊杰 邵珠福

(遼寧醫學院附屬第一醫院普外科，遼寧 錦州 121001)

大腸癌是最常見的消化道腫瘤之一，其發病率和死亡率在全球范圍內呈逐年上升趨勢〔1〕。在我國，隨著人們生活水平的提高和飲食結構的改變，大腸癌尤其是結腸癌的發病率迅速上升，僅次于胃癌和食管癌，發病年齡趨于老齡化〔2〕。近年來，化療在大腸癌患者術后復發、轉移及晚期轉移性大腸癌等患者的治療中收到較好的治療效果〔3〕，可以明顯延長患者的生存期，提高患者的生活質量，改善預后，其中奧沙利鉑在大腸癌的化療中有較大優勢。然而，腫瘤耐藥常使患者術后化療失敗。大腸癌的化療耐藥涉及多個方面，其中細胞對藥物誘導凋亡耐受及凋亡閾值增高是大腸癌耐藥的主要機制之一〔4〕。因此，如何恢復大腸癌對化療藥物誘導的凋亡途徑的敏感性成為大腸癌耐藥研究的焦點問題。本研究旨在通過檢測凋亡抑制蛋白Survivin、Livin、p53及Bcl-2在大腸癌組織中的表達，探討其與化療藥物奧沙利鉑化療敏感性的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2011年4月至2012年3月遼寧醫學院附屬第一醫院經手術病理證實的74例大腸癌患者，其中男性49例，女性25例；年齡35～81歲，平均(62.2±3.7)歲；結腸癌31例，直腸癌43例。所有患者術前均未行任何治療。術中取約1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm大小的新鮮腫瘤組織，放入含100 U/ml青霉素+200 μg/ml鏈霉素的培養液中培養。同時取20例經病理證實無腫瘤殘留的組織切緣作為正常對照組。

1.2免疫組化檢查凋亡相關蛋白Survivin、Livin、p53、Bcl-2的表達 每例患者術中切除的腫瘤標本用10%甲醛溶液固定，常規石蠟包埋后行4 μm連續切片，行免疫組化SP法檢測病灶Survivin、Livin、p53、Bcl-2蛋白表達情況。采用鼠抗人Survivin、Livin、p53、Bcl-2單克隆抗體，購自Imgenex公司(Livin)及Santa Cruz公司(Survivin、p53、Bcl-2)，DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術公司，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。以PBS代替一抗作為陰性對照、已知陽性切片作為陽性對照。

所有病理切片由2名病理科醫師在未知患者情況的前提下閱片，每張切片取5個400倍視野觀察，每個視野計數100個細胞，記錄陽性細胞數。Survivin、Bcl-2以細胞膜或細胞質染色為陽性，Livin以細胞質及細胞核染色為陽性，p53以細胞核染色為陽性，并按照細胞著色強度和陽性細胞率進行計分：無著色、淺黃色、棕黃色、棕褐色分別記為0、1、2、3分；陽性細胞≤5%、6%～25%、26%～50%、51%～75%、≥76%分別記為0、1、2、3、4分。以兩者評分相加判斷蛋白表達強度：0～1分(-)，2～3分(+)，4～5分()，6分以上()；≤3分為弱表達，≥4分為強表達〔5〕。

1.3腫瘤細胞對奧沙利鉑化療的敏感性檢測 將腫瘤組織研磨分散，用0.25%胰酶消化后，置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中，以細胞分離器調整細胞濃度至5×105個/ml，將奧沙利鉑(江蘇恒瑞醫藥公司)以無菌生理鹽水配成血藥峰值濃度142 μg/ml〔6〕。給藥組設6個復孔，同時以PBS溶液作為空白對照。以96孔板接種腫瘤細胞200 μl/孔，振蕩混勻后放入37℃、5% CO2培養箱中孵育48 h，然后加入5 mg/ml MTT繼續培養4 h，再加入DMSO 100 μl/孔振蕩混勻溶解結晶，在酶標儀上于570 nm波長處測定各空的光密度值，并計算腫瘤細胞抑制率：腫瘤細胞抑制率=(1-藥物組OD值/對照組OD值)×100%。

2 結 果

2.1大腸癌組織Survivin、Livin、p53、Bcl-2蛋白表達情況 大腸癌組Survivin、Livin、p53及Bcl-2蛋白強陽性表達率分別有58例(78.38%)、57例(77.03%)、41例(55.41%)、26例(35.14%)。而正常對照組織中僅1例表達Survivin、2例表達Livin、1例表達Bcl-2，且均為弱陽性表達。大腸癌組織與正常對照組織Survivin、Livin、p53及Bcl-2蛋白表達率比較，差異均有統計學意義(χ2=4.53、3.81、3.62、2.55，P<0.01)。

2.2大腸癌組織Survivin、Livin、p53、Bcl-2蛋白表達的相關性 Spearman相關分析結果顯示，大腸癌組織中Survivin與Bcl-2蛋白表達強度呈正相關(r=0.412，P<0.05)，其他蛋白表達強度間均無明顯相關性(r=0.126～0.288，P>0.05)。

2.3大腸癌患者Survivin、Livin、p53、Bcl-2蛋白表達與奧沙利鉑化療敏感性的關系 Survivin蛋白強表達組中，奧沙利鉑對腫瘤細胞的抑制率(36.3±6.1)%顯著高于Survivin蛋白弱表達組〔(22.4±3.5)%，t=3.305，P<0.01〕。Livin蛋白強表達組中，奧沙利鉑對腫瘤細胞的抑制率顯著低于Livin蛋白弱表達組〔(24.6±4.7)% vs (33.5±5.4)%，t=1.900，P<0.05〕。Bcl-2蛋白強表達組中，奧沙利鉑對腫瘤細胞的抑制率顯著高于Bcl-2蛋白弱表達組，兩者差異有統計學意義〔(34.4±3.9)% vs(27.1±3.2)%，t=2.210，P<0.05〕。p53蛋白強表達組與弱表達組比較，奧沙利鉑對腫瘤細胞的抑制率差異無統計學意義〔(31.7±5.8)% vs (30.6±5.0)%，t=0.063，P>0.05〕。

3 討 論

大腸癌的發生、發展與細胞凋亡密切相關，而多種凋亡相關蛋白在大腸癌的發生、發展及耐藥中發揮重要作用。因此，檢測凋亡相關蛋白的表達對于監測大腸癌的治療效果、轉移、復發及耐藥尤為重要。Survivin和Livin蛋白均為凋亡抑制蛋白家族中的重要成員，兩者在肺癌、乳腺癌、宮頸癌、黑色素瘤及消化系統腫瘤組織中均呈高表達〔7〕，而在正常組織中呈低表達或不表達。Survivin是已知作用最強的凋亡抑制因子，其在組織中的高表達通過抑制Caspase-3和Caspase-7的活性〔8〕，進一步抑制細胞程序性死亡及化療藥物誘導的細胞凋亡。Livin的抗凋亡作用受到線粒體釋放的Caspase活化蛋白Smac的調節〔9〕。Livin還能抑制化療藥物介導的細胞凋亡〔10〕，阻斷Livin的表達可以促進白血病細胞的凋亡，并能增強化療藥物的抗癌作用。

本研究結果與黎軍和〔11〕的研究結果一致，提示Survivin、Livin、p53及Bcl-2蛋白的高表達可能與大腸癌的發生及發展有關。相關分析結果顯示，大腸癌組織中Survivin與Bcl-2蛋白表達強度呈正相關與韓杰等〔12〕報道的結果一致，其可能原因為Survivin在Bcl-2的下游直接抑制Caspase的活性，進而協同阻斷細胞凋亡。而Survivin與Livin蛋白表達之間并無明顯的相關性，表明Survivin與Livin蛋白可能通過不同的作用機制來抑制腫瘤細胞凋亡。

奧沙利鉑對結直腸癌、乳腺癌、卵巢癌、非小細胞性肺癌等多種腫瘤均有較好的療效，尤其是對順鉑類耐藥的腫瘤具有顯著抑制作用，與5-FU聯合用于治療結直腸癌作為一線治療用藥顯示出較好的優勢〔13，14〕。本研究提示Livin可能與大腸癌患者對奧沙利鉑的耐藥有關，并在大腸癌患者化療耐受中起到重要作用。抑制Livin蛋白的表達可以抑制腫瘤細胞增殖、促進細胞凋亡，并可能逆轉腫瘤耐藥、提高圍術期化療效果，可能成為大腸癌基因治療的一個新靶點。

總之，凋亡抑制蛋白Survivin、Livin、p53及Bcl-2在大腸癌組織中均呈高表達，Livin蛋白在大腸癌組織中的表達可能與奧沙利鉑化療耐藥有關，可以臨床選擇化療藥物提供指導。

4 參考文獻

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