MicroRNAs在阿爾茨海默病發病中的作用

牛靜亞 張 睿 許順江

(河北醫科大學第一醫院中心實驗室，河北 石家莊 050031)

目前，全世界有2 000多萬阿爾茨海默病(AD)患者，尚無特效治療或逆轉病情的藥物。AD的病因極其復雜，一般認為與遺傳、環境及二者相互作用有關，并且發病機制還不十分明確。MicroRNA是一種長度為20～24個核苷酸的5′端帶磷酸基團、3′端帶羥基的內源性非編碼小RNA，在生物體內具有重要作用。miRNAs不僅參與生理過程的調控，在疾病的發生以及機體對藥物的反應等生命過程中也發揮重要調節作用，可通過多種途徑影響疾病的發生、發展與轉歸。利用生物信息學的方法估計生物體內約有三分之一編碼蛋白的基因受miRNAs的調控〔1〕。目前已經發現的人類miRNAs超過1 400個(miRBase Release 17)，它們在生物體內既是代謝產物，也是機體有目的編碼的重要調控分子。因此，miRNAs調控紊亂可能是人體多種疾病發生的潛在因素。越來越多的證據表明，miRNAs可能參與了AD的發生發展過程，本文概述miRNAs在AD發病中的研究進展及前景。

1 miRNAs的生物合成及其在神經系統中的功能

miRNAs對器官發育和細胞穩態十分重要，主要包括外顯子miRNAs和內含子miRNAs。外顯子miRNAs，例如let-7和lin-4，首先由細胞核內編碼miRNAs的基因轉錄成pri-microRNAs，然后被Drosha酶剪切成長約70 bp的發夾狀pre-miRNAs，接著被轉運蛋白(Exportin-5)從核內轉運至胞質中，Dicer酶將其剪切成長約22 bp的成熟miRNAs:miRNAs*，其中miRNAs鏈被RNAase降解，另一條鏈與Argonaute蛋白緊密結合，形成非對稱的RNA誘導沉默復合物(RISC)復合物(RNA-induced silencing complex)，該復合物中的miRNAs以特異或非特異的方式與其靶mRNA的3′-非翻譯區(UTR)結合，從而引起靶基因的降解或翻譯抑制。與外顯子miRNAs不同，內含子miRNAs在mRNA的內含子加工過程中產生，但二者的作用方式相同。miRNAs幾乎調控機體的每一個生理過程，并且調控網絡極其復雜。一種miRNAs可調控上百種靶基因的表達。反之，一種mRNA也可同時接受若干種miRNAs的協同調節。

miRNAs廣泛存在真核生物中，尤其在哺乳動物及嚙齒類動物腦中含量相當豐富，在進化上具有高度保守性、時序性和組織特異性。miRNAs參與了神經元的生長、分化等多個生理過程。例如，miR-134在海馬神經元的突觸中表達，通過抑制單絲氨酸蛋白激酶1(LIMK1)的翻譯調控突觸可塑性〔2〕。miR-30a-5p在人類額前皮質椎體神經元中表達豐富，可負性調控腦源性神經營養因子(BDNF)的表達〔3〕。Abdelmohsen等〔4〕發現miR-375通過負性調控RNA結合蛋白HuD的表達影響神經元的分化。由于miRNAs參與了腦細胞的分化、發育、凋亡等各種生理過程，大腦中任何miRNAs的異常表達都可能影響神經元的存活和它對神經退行性變的抵抗作用，而通過調控這些異常表達miRNAs則可能達到治療疾病的目的。

2 miRNAs在AD發生中的調控作用

AD是一種進行性發展的致死性神經退行性疾病，病變最易累及與高級認知功能有關的腦區，特別是新皮質和海馬，臨床表現為認知和記憶功能進行性惡化，日常生活能力不斷減退，常伴有各種神經精神癥狀和行為障礙。目前主要是通過膽堿酶抑制劑、精神類藥物結合家庭護理和理療進行治療，但并不能抑制疾病的進一步發展。目前，有大量研究表明miRNAs參與了AD的發病過程并有可能起著關鍵作用。Bilen等〔5〕在整體水平采用突變果蠅dicer1基因的手段和離體水平siRNA干擾HeLa細胞中dicer1蛋白表達的方法抑制miRNAs成熟，結果發現病理性Tau蛋白或多聚谷氨酰胺(polyQ)誘導的神經退行性損害加重，說明miRNAs在神經退行性疾病中發揮了重要調節作用，但miRNAs的具體調節機制還不甚明了。

2.1AD病變的共同病理特征 AD的神經病理改變主要是腦皮質彌漫性萎縮、溝回增寬、腦室擴大，組織病理改變主要是皮質神經元數量減少、神經纖維纏結(NFT)、含有β-淀粉樣肽(Aβ)的老年斑(SP)的出現、相關腦區(基底前腦、海馬和新皮層等)內神經突觸和錐體神經元消失、腦血管淀粉樣改變等。NFT的發生主要由于Tau蛋白的磷酸化，SP的淀粉樣沉積物主要成分是Aβ，而Aβ是由淀粉樣前體蛋白(APP)經β分泌酶(BACE)1/γ-分泌酶分解而來，諸多學者認為Aβ在AD的發病機制中起著十分重要的作用。

2.2miRNAs對AD主要致病基因的調控 APP蛋白在細胞內以跨膜受體的結構形式存在，包括一條較長的細胞外N末端和一條較短的細胞內C末端。APP蛋白可能對神經元的可塑性、神經元的生長和神經突外生有重要作用。APP蛋白有三個主要亞型，分別由APP基因外顯子7、8和15的選擇性剪切產生。正常神經元的APP基因僅包括外顯子15，而缺乏外顯子7和8，但在AD患者大腦中發現由APP基因外顯子7和8編碼的蛋白增多。Smith 等〔6〕最近研究證明，正常人腦中miR-124通過抑制PTBP1的表達，促進APP基因外顯子7和8的選擇性剪切。而AD病人腦中miR-124的表達明顯減少，致使APP基因外顯子7和8的選擇性剪切減少，神經元中APP蛋白亞型大量增多。最近Liu等〔7〕發現，SAMP8鼠的大腦中APP蛋白表達量明顯增多，但其mRNA卻沒有明顯變化，提示存在APP的轉錄后調控。他們利用miRanda軟件進行分析，發現APP mRNA的3′-UTR存在miR-16的結合位點，并進一步驗證了miR-16對SAM鼠內源性APP的負性調控作用。Vilardo等〔8〕通過定位誘變研究發現，APP基因的3′-UTR存在miR-101的識別位點，miR-101表達的減少可導致APP蛋白的表達增多，從而影響Aβ的沉積。APP mRNA的3′-UTR不僅存在miR-101的直接作用靶點還存在miR-106a，miR-520c〔9〕和miR-20家族〔10〕的直接作用靶點。綜上，作為轉錄后調節因子，miRNAs在AD的發生發展過程中起著重要的調控作用，特定miRNAs異常表達可能影響APP基因或蛋白的表達，從而促進AD的發生或惡化。但是，某一靶基因的表達又受多個miRNAs的調控，疾病發生過程中各種miRNAs之間又存在著怎樣一種制約與協同關系還有待進一步研究。

Aβ是由39～43個氨基酸殘基組成的蛋白質，為APP經BACE1/β分泌酶水解產物，是構成SP核心和血管壁沉積物的主要成分。Aβ的逐漸積累是AD發生的主要原因，而Aβ的異常沉積除了與APP表達增多關系密切外，還與BACE1的異常表達密不可分。Wang等〔11〕通過對不同階段的AD患者大腦中異常表達的miRNAs研究發現，miR-107在AD發病早期表達即明顯下降，并且miR-107可能通過負性調控BCAE1蛋白的表達影響AD的病理進程。同時，Hébert等〔12〕在散發的AD患者腦中觀察到，miR-29a/b和BCAE1蛋白的表達呈現明顯的負相關，且BCAE1 mRNA的3′-UTR存在miR-29a/b的結合位點，在APP mRNA的3′-UTR存在let-7、miR-15a、miR-101和miR-106b的結合位點，而所有這些miRNAs在AD病人的腦中表達量均下降。此外，他們還在細胞水平驗證了miR-29a/b對內源性BCAE1蛋白的負性調控作用。Boissonneault等〔13〕研究發現miR-298和miR-328可負性調控BACE1蛋白的表達，但其在老齡化的APPswe/PS1轉基因小鼠海馬表達量卻明顯降低。綜上，多個miRNAs均可負性調控BCAE1蛋白的表達，特定的miRNAs表達異常均有可能導致BCAE1蛋白表達增多，從而促進Aβ的沉積和AD的發生。

微管是神經細胞骨架成分，由微管蛋白及微管相關蛋白組成，參與多種細胞功能。tau基因位于17號染色體長臂，其表達產物是含量最高的微管相關蛋白。正常人腦中Tau蛋白有6種同功異構體，僅含有2～3個磷酸基。而AD患者腦的Tau蛋白過度磷酸化，每分子Tau蛋白可含5～9個磷酸基，并喪失正常生物功能。近年來，有關miRNAs對AD病人腦中Tau蛋白磷酸化的影響也有了進一步的研究。ERK1是Tau蛋白磷酸化過程中的重要調控因子，miR-15家族通過負性調控ERK1的表達影響Tau蛋白磷酸化的過程，但在AD患者的腦中miR-15家族的表達量卻明顯減少，進一步證明了miRNAs在AD發病過程中的重要調控作用〔14〕。同時，也有研究證明，miR-128參與Bcl-2結合抗凋亡基因(BAG)2/熱休克蛋白(HSP)70復合物對不溶性Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白的清除〔15〕。綜上，多種miRNAs參與了AD的發病過程，但是其調控又具有一定的復雜性，miRNAs能否如患者腦脊液中的Aβ、總Tau蛋白及磷酸化的Tau蛋白等分子一樣作為AD早期診斷的分子標志，尚待進一步的研究。

2.3miRNAs對AD其他非特異性致病因子的調控 AD的發病是一個極其復雜的過程，miRNAs除了對特異性致病基因(APP、Aβ、tau)有調控作用外，對其他致病因子也具有重要調控作用。Sethi等〔16〕發現miR-146a受核因子(NF)-κB的直接調控，而miR-146可以通過負性調控補體因子H的表達以對抗大腦的炎癥反應進而影響AD進展。Yao等〔17〕通過研究AD模型鼠發現，miR-103和miR-107抑制肌動蛋白結合蛋白cofilin的表達，二者表達水平的降低會導致肌動蛋白結合蛋白cofilin的表達過量，進而影響細胞結構骨架的變化，使神經細胞更易受損。Wang等〔18〕通過對APPswe/PS△E9轉基因小鼠的研究發現，轉化生長因子(TGF)-β二型受體(TβR Ⅱ) mRNA的3′-UTR存在miR-106b的作用位點，miR-106b可以負性調控TβR Ⅱ的翻譯，且通過體外細胞實驗印證了這一結果。一定程度上說明了TGF-β信號通路在AD發病過程中起著重要作用。綜上，miRNAs的表達異常不僅對AD發病過程中的標志性蛋白的表達有影響，而且會通過影響其他致病因子的表達導致細胞信號通路的改變，而這些改變都有助于AD的發生。

3 存在的問題及展望

目前對于miRNAs在AD發病機制中的作用已取得了一定的進展，但仍存在一定的局限性和挑戰：①每種miRNAs可作用于多個靶基因，僅集中與一種靶基因的研究無疑忽視了miRNAs的總體效應及各種靶蛋白的協同作用。②每個靶基因可能受多種miRNAs調控，僅集中于一種miRNAs的影響，可能混淆生物效應的真實性。③動物模型對疾病發病機制的研究具有重要價值，但是由于人體的復雜性其結果并不能直接用于人體。④每一種miRNAs可在多大程度上調控哪些靶蛋白的表達還有待進一步研究。⑤細胞內miRNAs的自身調控及反饋調控及確定調控miRNAs的機制還需深入探討。

miRNAs的廣泛發現及其對腦組織發育、神經細胞分化、突觸功能的影響，使人們對神經系統疾病的認識更進一步，篩選與疾病相關的miRNAs及其靶基因和相應的蛋白表達的改變仍將是該領域的研究熱點。隨著人類對miRNAs研究的不斷深入，miRNAs和疾病之間的關系可能更加明了，miRNAs可能成為疾病診斷新的生物學標記，鑒于miRNAs在AD發病機制中的作用還有待于進一步揭示，利用寡核苷酸抑制高表達的miRNAs或miRNAs干擾某些致病基因的過量表達有望成為疾病治療的新途徑。

4 參考文獻

1Lewis BP，Burge CB，Bartel DP.Conserved seed pairing，often flanked by adenosines，indicates that thousands of human genes are microRNA target〔J〕.Cell，2005;120(1)：15-20.

2Schratt GM，Tuebing F，Nigh EA,etal.A brain-specific microRNA regulates dendritic spine development〔J〕.Nature，2006;439 (7074)：283-9.

3Mellios N，Huang HS，Grigorenko A,etal.A set of differentially expressed miRNAs，including miR-30a-5p，act as post-transcriptional inhibitors of BDNF in prefrontal cortex〔J〕.Hum Mol Genet，2008;17(19)：3030-42.

4Abdelmohsen K，Hutchison ER，Lee EK,etal.miR-375 inhibits differentiation of neurites by lowering HuD levels〔J〕.Mol Cell Biol，2010；30(17)：4197-210.

5Bilen J，Liu N，Burnett BG,etal.MicroRNA pathways modulate polyglutamine-induced neurodegeneration〔J〕.Mol Cell，2006;24 (1)：157-63.

6Smith P，Al Hashimi A，Girard J,etal.In vivo regulation of amyloid precursor protein neuronal splicing by microRNAs〔J〕.J Neurochem，2011;116(2):240-7.

7Liu W，Liu C，Zhu J,etal.MicroRNA-16 targets amyloid precursor protein to potentially modulate Alzheimer′s-associated pathogenesis in SAMP8 mice〔J〕.Neurobiol Aging，2010;33(3):522-34.

8Vilardo E，Barbato C，Ciotti M,etal.MicroRNA-101 regulates amyloid precursor protein expression in hippocampal neurons〔J〕.J Biol Chem，2010;285(24)：18344-51.

9Patel N，Hoang D，Miller N,etal.MicroRNAs can regulate human APP levels〔J〕.Mol Neurodegener，2008;6：3-10.

10Hébert SS，Horré K，Nicola L,etal.MicroRNA regulation of Alzheimer′s amyloid precursor protein expression〔J〕.Neurobiol Dis，2009;33(3)：422-8.

11Wang WX，Rajeev BW，Stromberg AJ,etal.The expression of microRNA miR-107 decreases early in Alzheimer′s disease and may accelerate disease progression through regulation of beta-site amyloid precursor protein-cleaving enzyme 1〔J〕.J Neurosci，2008;28(5):1213-23.

12Hébert SS，Horré K，Nicola? L,etal.Loss of microRNA cluster miR-29a/b-1 in sporadic Alzheimer′s disease correlates with increased BACE1/beta-secretase expression〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,2008;105(17)：6415-20.

13Boissonneault V，Plante I，Rivest S,etal.MicroRNA-298 and microRNA-328 regulate expression of mouse β-amyloid precursor protein-converting enzyme 1〔J〕.J Biol Chem，2009;284(4):1971-81.

14Hébert SS，Papadopoulou AS，Smith P,etal.Genetic ablation of Dicer in adult forebrain neurons results in abnormal tau hyperphosphorylation and neurodegeneration〔J〕.Hum Mol Genet， 2010;19(20)：3959-69.

15Carrettiero DC，Hernandez I，Neveu P,etal.The cochaperone BAG2 sweeps paired helical filament- insoluble tau from the microtubule〔J〕.J Neurosci，2009;29(7):2151-61.

16Sethi P，Lukiw WJ.Micro-RNA abundance and stability in human brain：specific alterations in Alzheimer′s disease temporal lobe neocortex〔J〕.Neurosci Lett，2009;459(2):100-4.

17Yao J，Hennessey T，Flynt A,etal.MicroRNA-related cofilin abnormality in Alzheimer′s disease〔J〕.PLoS One，2010;5(12):e15546.

18Wang H，Liu J，Zong Y,etal.miR-106b aberrantly expressed in a double transgenic mouse model for Alzheimer′s disease targets TGF-β type Ⅱ receptor〔J〕.Brain Res，2010;1357:166-74.