雙歧桿菌分子分型鑒定研究進展

劉洋,張清平,段文鋒

(上海市質量監督檢驗技術研究院 國家食品質量監督檢驗中心(上海)，上海200233)

0 引 言

雙歧桿菌是能在人和動物腸道內定植的益生菌，最早由法國巴斯德研究所Tissier博士于1899年首次從母乳喂養兒的糞便中分離發現，1924年命名為雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)[1]。大量研究表明，雙歧桿菌能抑制致病菌入侵和定植、調節機體免疫、降低膽固醇、抑制腫瘤發生等，在維持機體腸道微生態平衡和宿主健康方面發揮著重要的作用。因此，雙歧桿菌成為近年來食品、藥品研究開發的熱點，部分菌株大量用于嬰幼兒配方食品、保健食品、藥品的生產中。但雙歧桿菌發揮有益功能具有很強的菌株特異性，為此FAO/WHO益生菌評價指南中指出，精確的菌株識別是益生菌使用的前提[2]，因此，雙歧桿菌的分類鑒定一直是研究的重點和熱點。近年來，分子生物學方法成為雙歧桿菌分類鑒定的主要手段，本文就目前常用的分子分型鑒定技術特點和應用進展進行介紹。

1 雙歧桿菌屬的分類學進展

微生物分類是不斷發展變化的動態過程，雙歧桿菌也不例外[3-5]。早期的屬水平的鑒別方法都局限于形態學和生理生化方法，而雙歧桿菌屬的特征又很多樣化。從發現到20世紀中期，雙歧桿菌先后被劃入芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、擬桿菌屬、放線菌屬[4]。近30多年，分子生物學技術高速發展，從Scardovi最早利用DNADNA雜交的方法研究雙歧桿菌的分類開始，雙歧桿菌屬的命名從表型進入了遺傳型階段[6]。2004年，Liesbeth等根據DNA-DNA雜交、擴增片段長度多態性、atpD及groEL基因序列分析等將乳雙歧桿菌(B.lactis)重新劃分為動物雙歧桿菌乳亞種(B.animalis subsp.lactis)[7]；2008年，Mattarelli等根據DNA-DNA雜交、16S rDNA及hsp60基因序列分析、隨機擴增長度多態性、BOXPCR、變性梯度凝膠電泳等數據，將長雙歧桿菌(B.longum)重新劃分為3個亞種：長雙歧桿菌長亞種(B.longum subsp.longum)、長雙歧桿菌嬰兒亞種 (B.longum subsp.in fantis)、長雙歧桿菌豬亞種(B.longum subsp.suis)[8]。 2011年，Hidetoshi等發表了雙歧桿菌屬的一個新種B.kashiwanohense[9]。 2012年，Akihito Endo等發布了5個新種，B.reuteri,B.callitrichos,B.saguini,B.stellenboschense和B.biavatii[10]。截止目前，該屬包含41個種，9個亞種，模式種為兩歧雙歧桿菌(B.bifidum)。

2 雙歧桿菌屬的分子分型鑒定方法

目前，根據分子分型技術的原理不同主要可分為2大類，分別為基于測序的分型鑒定方法，基于DNA印跡的分型鑒定方法。其中基于測序的方法主要如16S rDNA和16S-23S rDNA間區序列分析、多位點測序分型方法(Multilocus sequence typing,MLST)。基于DNA印跡的方法又分為2小類，一類為無需PCR而直接根據基因組序列特征分型，如脈沖場凝膠電泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis,PFGE)、限制性片段長度多態性 分 析 (Restriction fragment length polymorphisms,RFLP)；一類為基于PCR技術的印跡法，如隨機擴增多態性DNA技術 (Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD)、擴增片段長度多態性分析(Amplified Fragment Length Polymorphism,AFLP)、rep-PCR方法(Repetitive ExtragenicPalindromic PCR,REP-PCR)。

2.1 基于測序的分型鑒定方法

2.1.1 16S rDNA和16S-23S rDNA ITS序列分析

16S rDNA序列分析是目前細菌分類鑒定中最常用和必須進行的一種鑒定分析方法，能確定細菌的新的分類命名地位。主要步驟包括：基因組DNA提取、16S rDNA的擴增、16S rDNA基因測序和序列分析。將目標序列與基因數據庫中16S rDNA序列比對，分析相似度和進化關系，確定分類地位。一般認為，16S rDNA序列93%～99%的相似度可認為是具有緊密親緣關系，有別于其他菌屬[11]。Stackebrandt等提出同種的16S rDNA基因序列同源性應大于97%，作為種水平的判別標準[6]。雙歧桿菌屬的16S rDNA序列相似度介于87.7%～99.5%之間，部分長雙歧桿菌、動物雙歧相似度達到99%以上，不具備種內區分雙歧桿菌的能力[12]。王濤等利用16S rDNA對人體糞便中分離的1株雙歧桿菌進行鑒定[13]。高鵬飛等利用16S rDNA對從12位健康蒙古族兒童糞便中分離得到11株雙歧桿菌進行鑒定，發現B.animalis V9與乳雙歧桿菌BB12的同源性為99%，有望在乳制品和保健產品中廣泛應用[14]。近年來，二代測序技術的發展，使得益生菌菌群分析進行高通量時代。Gulitz等研究者利用基于焦磷酸測序的16S rDNA分析對水開菲爾(water kefir)發酵飲料進行菌群分析，發現大量的嗜冷雙歧桿菌(B.psychraerophilum)，針對16S rDNA的高通量測序技術將成為對發酵食品菌群進行深度分析的有力工具[15]。

16S rDNA和23S rDNA基因之間的區域，稱為內部轉錄間隔區(Internally transcribed spacer，ITS)，較16S rDNA和23S rDNA進化快，不同菌的序列長度和堿基差異較大，用于區分和鑒定親緣關系相近的種和菌株，是目前種及亞種水平鑒定最可信和準確的方法之一。主要步驟為：根據16S rDNA和23S rDNA末端的保守序列設計引物、對ITS序列進行擴增、對擴增產物測序并進行序列分析。該方法廣泛用于雙歧桿菌的分類鑒定及多態性研究中。Francesca等研究者利用16S rDNA和16S-23S ITS序列對人類腸道黏膜和糞便中900個分離菌株進行鑒定，發現了704株雙歧桿菌，主要有長雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、短雙歧桿菌等6種，在糞便、黏膜等腸道不同環境中分布有差異[16]。LI等通過表型鑒定、16S rDNA和16S-23S ITS從10株雙歧桿菌中篩選出動物雙歧桿菌乳亞種Qq08菌株，具有耐氧、耐酸和耐膽汁鹽能力，比商業化益生菌株BB12特性更好[17]。

2.1.2 半保守基因序列分析

除了16S rDNA和16S-23S rDNA ITS序列外，研究者也尋找到其他保守性略低的基因，通過測序分析，對菌種進行有效區分。如recA基因中一段300 bp的片段，有足夠的信息可用于雙歧桿菌屬大部分種的區分，還能對相近的種如動物雙桿桿菌乳亞種和動物亞種區分[18]。 16S rDNA、16S-23S rDNA ITS結合這些保守基因的序列分析，可在種及亞種水平對雙歧桿菌進行較精確的分型鑒定。Byoung等提出rpoB基因序列相似度84.1%～99.0%時，可以作為雙歧桿菌鑒定的有效分子標簽[19]。Loredana等利用hsp60基因對雙歧桿菌進行鑒定，認為該基因具有種及亞種水平的分辨力[20]。Sheu等采用tuf基因引物實現對發酵乳中雙歧桿菌部分種的分子鑒定[21]。 另外，還有groEL，recA，atpD，dnaK，grpE等基因。但是該類單基因分子尚無完善的數據庫，不足以提供全面的進化分析信息，菌株水平區分能力不夠；且由于缺乏有效的保守區域，基于這些基因設計種特異分型引物存在一定困難。

2.1.3 多位點測序分型

多位點測序分型 (Multilocus Sequence Typing，MLST)技術是1998年Maiden等提出，近年來發展較快的一種分子分型方法[22]。它選擇多個編碼蛋白的管家基因，進行序列測定，分析等位基因圖譜，進行聚類分析，根據位點序列賦予不同菌株序列型(Sequence type，ST)，對菌株進行多位點的精確分型。最早的MLST序列測定450 bp，基因個數7～10個，具有較好的分辨能力。與其他方法相比，該技術是標準化的測序技術；操作簡便，重復性好；數據能共享、動態補充和互相比較；分型精度可以和PFGE相媲美，達到菌株水平。目前全球共有4個較大的公共MLST數據庫(www.pasteur.fr/mlst，http://pubmlst.org/，http://www.mlst.net/，http://mlst.ucc.ie/)。

關于雙歧桿菌的MLST研究剛剛起步。2006年，Marco等人選擇7個保守的管家基因，clpC，dnaB，dnaG，dnaJ1，purF，rpoC和xfp，對雙歧桿菌常見種的模式菌株進行進化分析，比較7個基因建立的系統發育樹，結果比單基因建樹結果更全面、合理[12]。2010年，Alexis等研究者對119株動物雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、長雙歧桿菌、短雙歧桿菌進行clpC、purF等7個管家基因的MLST分析，共獲得104個ST型別，在兩歧雙歧、長雙歧、短雙歧種間區分度達到99%，具有精確菌株分型的能力[23]。 2011年，Hiroshi利用MLST和AFLP技術對母體中長雙歧桿菌轉移到嬰兒體內的過程進行溯源分析[24]。鑒于MLST方法能綜合多個管家基因的進化信息、易于標準化操作等諸多優點，有望成為雙歧桿菌進化分析的強有力的工具。

2.2 DNA印跡方法

2.2.1 直接針對基因組的DNA印跡方法

(1)脈沖場凝膠電泳。

脈沖場凝膠電泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE)是目前菌株鑒定，包括雙歧桿菌鑒定的金標準方法。其操作步驟為：細菌培養后在瓊脂糖凝膠塊中裂解，用稀有酶切位點的內切酶作用，脈沖場凝膠電泳分離。DNA帶譜反映了目標基因組特異的序列分布，可以作為分型的依據。該方法能反映雙歧桿菌全基因組中較多的變異信息，具有重復性好、分辨率高、結果穩定等優點，比16S rDNA方法分辨力更高，具備菌株水平溯源能力，是菌株多相鑒定技術的常用方法之一。

PFGE自1996年用于雙歧桿菌的分型鑒定中。2006年，Briczinski等改進了雙歧桿菌PFGE技術的條件，大大縮短了該方法的操作時間[25]。Marius等對市售益生菌乳制品中的雙歧桿菌進行計數分析，并用PFGE分析對包括酸乳在內的乳制品中雙歧桿菌鑒定，發現所有分離菌株和BB12等3個商業菌株譜型一致，均為動物雙歧桿菌，推測不同名稱的商業菌株可能來源相同[26]。Kheadr等利用PFGE法對14株母乳喂養新生兒體內分離的雙歧桿菌進行分子鑒定，16S rDNA技術發現這些分離株與thermacidophilum豬亞種有98%-99%的相似性，進一步用PFGE分析將其分為4種酶切圖譜，認為該類亞種在新生兒體內的存在將幫助形成嬰兒的腸道生境[27]。Aires等利用PFGE和BOX-PCR對15個嬰兒體內動態收集4次獲得的雙歧桿菌進行分析，發現不同嬰兒體內有不同的雙桿桿菌優勢菌種，隨著時間而變化，利用該法可以對嬰兒體內雙歧桿菌菌群分布進行動態分析，用于調節嬰兒飲食方案[28]。但PFGE的不足為操作復雜、步驟繁瑣、需要特殊設備和易受操作者經驗影響，是該法的應用限制。

(2)限制性片段長度多態性分析。

限制性片段長度多態性分析 (Restriction Fragment Length Polymorphisms，RFLP) 于1980年最先提出，是發展最早的DNA印跡技術之一。主要步驟為：限制性內切酶切割基因組DNA、凝膠電泳、轉膜、探針標記特定DNA片段。DNA片段數目和長度反映了DNA分子上不同酶切位點的分布。是可用于種間鑒定的一種DNA指紋方法。

目前，傳統的RFLP技術使用較少，常與PCR聯用，稱為PCR-RFLP。即先針對16S rDNA或其他靶標基因設計擴增引物，再對擴增片段酶切，從而把不同多態性的菌株序列區分開來。該方法既利用了PCR的片段選擇特異性，又發揮了RFLP對多態性的分析能力，比單個技術的分辨力要高。Loredana等建立了一種針對hsp60基因的PCR-RFLP方法，先用引物擴增hsp60基因中一段590 bp的片段，而后用HaeⅢ對擴增產物酶切，能對25個雙歧桿菌不同的種，以及動物雙歧、假長雙歧桿菌的部分亞種進行區分[20]。還有一種新的非培養的低分辨群落分析技術也基于RFLP，稱為T-RFLP。該方法在擴增引物的一端加上熒光標記，對目標序列擴增后再酶切，而后用專門的讀圖設備分析鋒形，與模式菌株純培養制備的鋒形比較，通過軟件的計算獲得混合樣本中的細菌群落分布情況，分型水平到屬或屬以下。Fei Sjoberg等利用T-RFLP技術和培養方法比較分析了部分出生1周到12個月的嬰兒糞便，認為T-RFLP方法對不可培養厭氧菌種的檢測更加穩定，為一種靈敏、具備合適區分力的腸道微生物組成分析方法[29]。

2.2.2 基于PCR的DNA印跡方法

(1)隨機擴增多態性DNA技術。

隨機擴增多態性DNA (Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD)技術是由WILLIAMS和WELSH同時發展起來的一種DNA標記技術。其原理是針對目標菌株基因組DNA，以單一的隨機寡核苷酸序列為引物進行PCR擴增，片段經凝膠電泳分離后呈現出DNA指紋圖譜，分析基因組多態性特征對菌株分類鑒定。RAPD技術可在基因組序列未知的情況下進行，設計和實驗簡單，在雙歧桿菌鑒定中應用廣泛。

董明盛采用RAPD技術，用10條引物對7種9株雙歧桿菌基因組進行PCR擴增,發現引物S256對雙歧桿菌種及同種不同株均具有良好的區分能力，由擴增圖譜建立的聚類樹狀圖能準確反映雙歧桿菌的系統發育關系[30]。Hidenori等研究者用RAPD技術對母親和哺乳嬰兒體內分離的各50株短雙歧桿菌進行多態性分析，發現部分母體短雙岐桿菌轉移到嬰兒體內，成為嬰兒腸道早期定植菌，具有更高的生長活力[31]。但早期的RAPD引物為非特異性，擴增受到PCR條件等多重因素影響，重復性和穩定性相對較低。近年來，研究者篩選更多的RAPD引物，挑選出菌株特異的區分引物，提高了傳統RAPD方法的分型精度，達到菌株水平。如Toshimitsu等篩選了97對RAPD引物，挑選出能特異區分兩歧雙歧桿菌OLB6378的菌株特異性RAPD引物，可用于該特定菌株的檢測和計數[32]。

(2)擴增片段長度多態性分析。

擴增片段長度多態性分析 (Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)是一種建立在PCR技術和RFLP技術基礎上的檢測DNA多態性的分子分型技術。其主要步驟為：先對基因組DNA經限制性內切酶雙酶切；將含有粘性末端的接頭與酶切片段連接，作為擴增模板；以特異接頭序列作為引物PCR，獲得不同長度的擴增片段；凝膠電泳分離后對圖譜分析進行菌種鑒定。該技術既具有RAPD技術的高效性和方便性，又兼顧RFLP技術的可靠性和重復性，能對部分遺傳關系相近的雙歧桿菌進行區分。Dimitrov利用XhoⅠ和TaqⅠ兩個酶，建立了一種具有高度菌株特異性的AFLP分型方法，對20個分離自健康人體的雙歧桿菌鑒定，結果比PFGE的分辨力更高，操作也更簡便[33]。Hiroshi等利用AFLP和MLST方法，對8對母親和嬰兒的長雙歧桿菌進行追溯，發現其中11個長雙歧桿菌長雙歧亞種在母親和嬰兒的糞便中是同型的，這些菌株從出生后就定植在嬰兒的腸道內，具有母體-嬰兒的家族特異性[24]。

(3)細菌基因組重復序列PCR技術。

細菌基因組重復序列PCR技術 (Repetitive DNA element PCR，Rep PCR)是1996年首先提出，主要原理是對細菌DNA中廣泛分布的短重復序列 (長度從30-40bp到150bp不等)擴增，電泳分析產物條帶，從而揭示基因組DNA之間的差異。主要有基因外重復回文系列(Repetitive Extragenic Palindromic，REP)、腸桿菌基因間重復一致序列 (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus，ERIC)和BOX插入因子等幾類。Rep-PCR技術操作簡單，分辨效果好，可自動化，并可建立菌種REP-PCR、ERIC-PCR分型數據庫，近年來發展較快，也有學者將其應用于雙歧桿菌分類鑒定中。

Ventura等利用ERIC-PCR對26個菌種的89個菌株進行分析，發現該方法能對大部分菌種有效區分，但對相近的種區分力較低，如鏈狀雙歧桿菌和假鏈狀雙歧桿菌[34]。Masco等用BOX-PCR技術對128個雙歧桿菌模式菌株、參考菌株和分離菌株鑒定，發現BOXA1R引物的區分力最佳，能在種和亞種水平，部分甚至在菌株水平鑒定，重現率高達92.5%～97%[35]。Waligora等利用Masco建立的BOX-PCR和多重PCR方法，對10個法國過敏癥嬰兒和20個對照者的胎糞中菌群分析，發現兩組嬰兒的菌種構成無明顯差別，都有大量的雙歧桿菌分布，雙歧桿菌的多樣性和過敏狀態之間無明顯關聯[36]。

3 結束語

隨著食品工業的快速發展，雙歧桿菌作為益生菌的一大類，已用于多種食品的開發，包括嬰幼兒配方乳粉。因為益生菌作用具有菌株特異性，精確的菌株鑒定技術不僅是各國學者研究的重點，也將成為我國益生菌食品安全監管的必然需求。傳統的生理生化技術已經不能滿足精確的分型鑒定要求，但仍然作為標準方法用于培養和初步分型。各種分子生物學技術成為雙歧桿菌分型鑒定的主流方法。

未來的雙歧桿菌分類鑒定中，基因組序列的直接測定將成為重要的發展方向，特殊半保守基因序列分析將成為16S rDNA序列分型的有力補充。MLST技術因為涵蓋更多的基因信息和易于全球共享數據的模式，在雙歧桿菌鑒定和相關研究中的應用將更廣泛。傳統的DNA印跡方法對于基因組中較大的差異有全局反映，但不能提供菌種以下的分辨力，應用將受到局限。基于細菌特異重復序列的rep-PCR以及改良過的DNA印跡方法如特異菌株位點RAPD、AFLP技術具有亞種或菌株水平的分辨力，將成為PFGE方法的優良候選。隨著雙歧桿菌基因組數據的不斷擴充，比較基因組分析將有助于開發精確的菌株鑒定技術，二代測序技術將在復雜生境下菌群快速分析中發揮更重要的作用。但無論哪一種方法，都應當與其他方法互為補充，取長補短，多相分型依然是重要的分型鑒定思路。

[1]呂錫斌,何臘平,張汝嬌,等.雙歧桿菌生理功能研究進展[J].食品工業科技.2013,34(16):353-358.

[2]Guidelines for the evaluation of probiotics in food.Joint FAO/WHO working group report on drafting guidelines for the evaluation of probiotics in food,London,Ontario,Canada,April 30 and May 1,2002.＜http://ftp://ftp.fao.org/es/esn/food/wgreport2.pdf＞.

[3]凌代文.乳酸細菌分類鑒定及實驗方法[M].北京：中國輕工業出版社,1999.

[4]HOLZAPFEL W H,HABREER P,GEISEN R,et al.Taxonomy and Important Features of Probiotic Microorganisms in Food and Nutrition[J].Amer J Clin Nutrit,2001,73(2):365–373.

[5]SIDARENKA A V,NOVIK G I,AKIMOV V N.Application of Molecular Methods to Classification and Identification of Bacteria of the Genus bifidobacterium[J].Microbiology,2008,77(3):251-260.

[6]趙婷,程池.MLSA用于雙歧桿菌快速鑒定研究進展[J].中國乳品工業.2011,39(6):46-50.

[7]LIESBETH M,MARCO V,RALF Z,et al.Polyphasic Taxonomic Analysis of Bifidobacterium Animalis and Bifidobacterium Lactis Reveals Relatedness at the Subspecies Level:Reclassification of Bifidobacterium Animalis as Bifidobacterium Animalis Subsp Animalis Subsp nov and Bifidobacterium Lactis as Bifidobacterium Animalis Subsp Lactis Subsp nov[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2004,54(4):1137-1143.

[8]MATTARELLI P,BONAPARTE C,POT B,et al.Proposal to Reclassify the Three Biotypes of Bifidobacterium Longum as Three Subspecies:Bifidobacterium Longum Subsp Longum Subsp nov,Bifidobacterium Longum Subsp Infantis comb nov and Bifidobacterium Longum Subsp Suis comb nov[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2008,58(4):767-772.

[9]MORITA H,NAKANO A,ONODA H.Bifidobacterium kashiwanohense sp nov.,Isolated from Healthy Infant Faeces[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology.2011,61(11):2610-2615.

[10]AKIHITO E,YUKA F E,PETER S.Bifidobacterium reuteri sp.nov.,Bifidobacterium callitrichos sp.nov.,Bifidobacterium saguini sp.nov.,Bifidobacterium stellenboschense sp.nov.and Bifidobacterium biavatii sp.nov.Isolated from Faeces of Common Marmoset(Callithrix jacchus)and Red-handed Tamarin(Saguinus midas)[J].Systematic and Applied Microbiology.2012,35(2):92-97.

[11]MIYAKE T,WATANABE K,WATANABE T,et al.Phylogenetic Analysis of the Genus Bifidobacterium and Related Genera Based on 16S rDNA Sequences[J].Microbiology and Immunology,1998,42(10):661–667.

[12]MARCO V,CARLOS C,ANTONIO D C,et al.Analysis of Bifidobacterial Evolution Using a Multilocus Approach[J].InternationalJournal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2006,56(12),2783–2792.

[13]王濤,孟祥晨.一株來源于人體的雙歧桿菌的分離與鑒定[J].東北農業大學學報,2008,39(7):107-111.

[14]高鵬飛,孫志宏,麻士衛,等.蒙古族兒童源益生特性雙歧桿菌的篩選及鑒定[J].微生物學報,2009,49(2):210-216.

[15]A GULITZ1,J STADIE1,M A EHRMANN.Comparative Phylobiomic Analysis of the Bacterial Community of Water Kefir by 16S rDNA Gene Amplicon Sequencing and ARDRA Analysis[J].Journal of Applied Microbiology,2013,114(4):1082-1091.

[16]FRANCESCA T,ELENA F,PAOLA P,et al.Exploring the Diversity of the Bifidobacterial Population in the Human Intestinal Tract[J].Applied And Enviromental Microbiology,2009,75(6):1534-1545.

[17]LI QQ,CHEN QH,HUI R.Isolation and Characterisation of an Oxygen,Acid and Bile Resistant Bifidobacterium animalis subsp lactis Qq08[J].Journal Of The Science Of Food And Agriculture,2010,90(8):1340-1346.

[18]VENTURA M,ZINK R.Comparative Sequence Analysis of the tuf and recA Genes and Restriction Fragment Length Polymorphism of the Internal Transcribed Spacer Region Sequences Supply Additional Tools for Discriminating Bifidobacterium lactis from Bifidobacterium animalis[J].Applied and Environmental Microbiology,2003,69(12):7517–7522.

[19]BYOUNG J K,HEE Y K,YEO J Y,et al.Differentiation of Bifidobacterium Species Using Partial RNA Polymerase β–subunit(rpoB)Gene Sequences[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2010,60(12):2697-2704.

[20]LOREDANA B,VERENA S,ERWIN S,et al.Identification of Species Belonging to the Bifidobacterium Genus by PCR-RFLP Analysis of a hsp60 Gene Fragment[J].BMC Microbiology,2013,13(1):149.

[21]SHEN S J,HWANG W Z,CHENG Y,et al.Use of tuf Gene-based Primers for the PCR Detection of Probiotic Bifidobacterium Species and Enumeration of Bifidobacteria in Fermented Milk by Cultural and Quantitative Real Time PCR Methods[J].Journal of Food science,2010,75(8):521-527.

[22]劉金華,賀丹等.多位點測序分型技術在病原微生物分型鑒定中的應用[J].微生物學通報,2007.34(6):1188-1191.

[23]DELETOILE A,PASSET V,AIRES J.Species Delineation and Clonal Diversity in Four Bifidobacterium Species as Revealed by Multilocus Sequencing[J].Research In Microbiology,2010,161(2):82-90.

[24]HIROSHI M,AKIRA K,EIJI I,et al.Transmission of Intestinal Bifidobacterium longum subsp.longum Strains from Mother to Infant,Determined by Multilocus Sequencing Typing and Amplified Fragment Length Polymorphism [J].Applied and Enviromental Microbiology,2011,77(19):6788-6793.

[25]BRICZINSKI E P,ROBERTS R F.Technical Note:a Rapid Pulsed-field Gel Electrophoresis Method for Analysis of Bifidobacteria[J].Journal of Dairy Science,2006,89(7),2424–2427.

[26]MARIUS G,MARIANNE K,ANDREAS B.Quantitative Analysis and Molecular Identification of Bifidobacteria Strains in Probiotic Milk Products[J].European Food Research and Technology,2003,217(1):90–92.

[27]KHEADR E,DABOUR N，VON A U.Genetic and Phenotypic Diversity of Bifidobacterium thermacidophilum Fecal Isolates from Newborns[J].Canadian Journal of Microbiology,2007,53(12):1348-1359.

[28]AIRESA J，THOUVEREZB M，ALLANOA S,et al.Longitudinal Analysis and Genotyping of Infant Dominant Bifidobacterial Populations[J].Systematic and Applied Microbiology，2011，34(7):536-541.

[29]FEI S,FOROUGH N,IGNACIO R.Comparison between Terminalrestriction Fragment Length Polymorphism(T-RFLP)and Quantitative Culture for Analysis of Infants'Gut Microbiota[J].Journal of Microbiological Methods,2013,94(1):37-46.

[30]董明盛,陳曉紅,江漢湖,等.雙歧桿菌基因組DNA提取及其遺傳多態性研究.中國乳品工業,2003,31(2):3-5.

[31]HIDENORI T,KATSUNAKA M,RYOU N.Comparative Analysis of the Properties of Bifidobacterial Isolates From Fecal Samples of Mother–Infant Pairs[J].Hepatology And Nutrition,2010,51(5):653-660.

[32]TOSHIMITSU T,NAKAMURA M,IKEGAMI S.Strain-specific I-dentification of Bifidobacterium bifidum OLB6378 by PCR[J].Biosci Biotechnol Biochem.2013;77(3):572-576.

[33]ZHECHKO D.Development Of Strain Discriminative Amplified Fragment Length Polymorpfic DNA For Bifidobacteria.Design Of Strain-Specific Markers[J].Biotechnology&Biotechnological Equipment,2012,26(1):35-38.

[34]VENTURA M,MEYLAN V,ZINK R.Identi?cation and Tracing of Bi?dobacterium Species by Use of Entero-bacterial Repetitive Intergenic Consensus Sequences[J].Applied and Environmental Microbiology,2003,69(7):4296–4301.

[35]MASCO L,HUYS G,GEVERS D,et al.Identi cation of Bi dobacterium Species Using rep-PCR Fingerprinting[J].Systematic and Applied Microbiology,2003,26(4):557–563.

[36]WALIGORA-DUPRIETA A J，CAMPEOTTO F，ROMEROA K,et al.Diversity of Gut Bifidobacterium Species Is not Altered between Allergic and Non-allergic French infants[J].Anaerobe,2011,17(3):91-96.