濃縮型凍干發酵劑在鴨肉發酵香腸中的應用

吳滿剛，王小蘭，陳洋洋，莊 濤，葛慶豐，于 海，汪志君*

（揚州大學食品科學與工程學院，江蘇 揚州 225127）

高效濃縮型凍干發酵劑是指菌種經液體增殖培養、濃縮分離，添加保護劑，進行干燥制成的菌粉發酵劑，也稱直投式發酵劑[1]。制備發酵劑目前常用的干燥工藝有：真空低溫干燥法、噴霧干燥法和真空冷凍干燥法（簡稱：凍干法），其中，真空低溫干燥和噴霧干燥在干燥過程中對菌體的損傷比較嚴重，導致發酵劑的活菌含量相對偏低；而凍干法制備的濃縮型發酵劑，不僅活菌含量高、發酵活力強，而且機械化程度高，便于保藏和運輸[2]。

由于國外的技術壟斷，凍干發酵劑大都從丹麥、法國、瑞典等國進口，所以凍干粉末發酵劑的國產化越來越受到重視[3]。近年來國內學者主要側重研究凍干發酵劑在酸奶制品[4]中的應用，而在肉制品中的應用研究較少。本研究以實驗室篩選的植物乳桿菌為目標菌株，并按照前期優化的工藝進行增殖培養、離心收集、真空冷凍干燥制備凍干發酵劑。分別將凍干發酵劑和液體發酵劑接種到鴨肉香腸中，以自然發酵香腸為對照組，探討鴨肉香腸發酵過程中pH 值、水分含量、酸價、過氧化值（peroxide value，POV）、游離脂肪酸等指標的變化和差異，研究在整個香腸發酵過程中，凍干發酵劑與液體發酵劑的相關特性和作用對比，為我國凍干發酵劑在肉制品中的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料、菌種與試劑

鴨脯肉 江蘇揚州石塔農貿市場。

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）L2本實驗室篩選。

增殖培養基[5]：蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母提取物5.0g、K2HPO42.0g、檸檬酸銨2.0g、乙酸鈉5.0g、葡萄糖20.0g、吐溫-80 1.0mL、MgSO4·7H2O 0.58g、MnSO40.25g，定容至1L，調pH6.2～6.4，115℃滅菌20min。待培養基冷卻后，按質量分數加入過濾除菌的胡蘿卜汁（8%）、香菇汁（8%）、番茄汁（10%）、CaCO3（0.5%）。

三氯甲烷、甲醇、丙酮、A-26樹脂、碘化鉀、異辛烷、乙酸、環己烷、三氯乙酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、硫代巴比妥酸（TBA），以上試劑均為分析純。脂肪酸內標為C15∶0色譜級。

1.2 儀器與設備

HD-3A型智能水分活度測量儀 無錫華科儀器儀表有限公司；ZHJH-21093型超凈工作臺 上海智城分析儀器公司；SPX-250B-Z型生化培養箱 上海博迅實業有限公司；RE-52AA型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；FlveEosy型pH計 美國Mettler Toledo公司；復合式75μm Car/PDMS萃取頭 美國Supelco公司；HITACH2 L-8500A型氨基酸自動分析儀 日本日立公司；Trace DSQⅡ型氣相色譜質譜聯用儀 美國Thermo Fisher電子公司；755s型紫外-可見分光光度計 上海棱光技術有限公司；GC-14B型氣相色譜儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化

將植物乳桿菌活化2次，以3%接種量將活化液接入裝有100mL MRS液體培養基的250mL三角瓶中，35℃搖床培養24h備用。

1.3.2 凍干菌粉制備流程

將增殖培養液4000r/min離心10min收獲菌體，用生理鹽水洗滌，重復兩次，加入原菌液體積1/10的復合保護劑（濃縮倍數按實際需要而定），混合均勻，以2mL分裝量分裝于凍干瓶中，預凍，真空冷凍干燥36h，得濃縮型凍干菌粉，4℃保藏。精確稱取1g凍干菌粉，溶于10mL無菌生理鹽水中，取1mL進行稀釋平板計數，從而換算出1g凍干菌粉的含菌量。

1.3.3 鴨肉香腸制作工藝流程

發酵劑的制備：將保藏菌株活化2次，以3%接種量接于營養肉湯培養基中，對增菌液進行活菌計數，以供接種之用。

香腸制備流程：原料肉預處理→絞碎→拌餡腌制→拌料接種→灌腸→高溫脫水→發酵→干燥成熟→真空包裝。發酵條件：溫度20℃，相對濕度90%～95%。

經活菌計數得，液體發酵劑活菌數實測為4.23×109CFU/mL，濃縮型凍干發酵劑活菌數為5.36×1011CFU/g，為保證兩個處理組香腸最初含菌量相同，則液體發酵劑接菌量約為100mL/kg，濃縮型凍干發酵劑接菌量約為1g/kg，凍干發酵劑先用無菌水溶解、混勻后加入腸餡中。

1.3.4 理化指標的測定

1.3.4.1 水分活度

稱取2g肉樣，絞碎，采用水分活度測量儀測定水分活度（aw）。

1.3.4.2 pH值

稱取5g肉樣絞碎，加入50mL蒸餾水，4℃混合反應30min后，過濾取上清液，用精密pH計測定pH值。

1.3.4.3 水分含量

參考GB/T5009.3—2003《食品中水分的測定》[6]對水分含量進行測定。

1.3.4.4 質構特性

用切片刀將樣品切成1cm3的立方體，“T”型金屬壓頭連在質構儀上，壓頭直徑40mm，壓縮比50%，測定速率：50mm/min，兩次循環[7]，測定項目：硬度、彈性、咀嚼性、膠黏性[8]。

1.3.4.5 酸價

稱取絞碎的肉樣3g，置于250mL錐形瓶中，加入50mL中性乙醚-乙醇（2∶1，V/V），振蕩使其溶解，也可置于熱水中，溫熱促其溶解，冷至室溫，加入酚酞指示劑2～3滴，以0.05mol/L KOH滴定至初現微紅色，30s不褪色為終點。按油脂酸價的測定方法進行滴定并計算樣品中的酸價[9]。

1.3.4.6 POV

參考GB/T5009.37—1996《食用植物油殘留溶劑測定》[10]測定POV值。

1.3.5 脂肪的提取

參考Vestegaard等[11]的測定方法，稱取充分破碎的肉樣10g于錐形瓶中，加入150mL的CM液（三氯甲烷-甲醇（2∶1，V/V）），培養箱中振蕩抽提3h（15℃，120r/min），過濾，濾液中加入1% NaCl溶液適量（約為濾液體積的1/2），等靜止分層后取下層氯仿液在40℃水浴下用旋轉蒸發儀濃縮，然后用氮氣吹干。

1.3.6 樹脂的處理

稱取A-26樹脂10g于錐形瓶中，加入100～200mL濃度為0.5mol/L的NaOH溶液，振蕩30min，傾去NaOH溶液，用去CO2水洗3次，每次振蕩20min，棄去洗 液，再用40mL甲醇分3次洗滌，每次振蕩20min，重復1次，最后保存于甲醇中[12]。

1.3.7 游離脂肪酸的分離與測定

參考傅櫻花等[13]的方法并加以改進。甲酯化試劑：1mL三氟化硼-甲醇溶液，1mL苯，1mL甲醇。取脂質50～100mg，加入15mL丙酮-甲醇溶液（2∶1，V/V），再加入100～200mg A-26。0.2～0.5mL C15內標，振蕩30min，靜止后棄去溶劑，再用丙酮-甲醇溶液15mL分4次洗滌樹脂，然后將樹脂洗入帶塞試管中，傾去丙酮-甲醇溶液，用氮氣吹干樹脂，加入3mL甲酯化試劑，加塞，沸水浴煮沸45min，取出冷卻后開蓋，加入2mL正己烷，1mL的蒸餾水，振蕩，分層，取1μL正己烷進行氣相色譜檢測。

氣譜條件：毛細管柱為SupelcowaxTM10（30m×0.25mm，0.25μm），涂層為聚乙二醇。進樣口溫度250℃；檢測器溫度260℃；載氣：氮氣；載氣流速：1.2mL/min；分流流速22mL/min；分流比：20∶1；尾吹氣：氫氣，32mL/min；空氣430mL/min；柱升溫程序：初溫80℃，以20℃/min升到210℃，再以3℃/min升到225℃，保持12min。

游離脂肪酸的定量方法：采用內標法進行定量，內標物為C15，峰面積采用歸一化法。飽和脂肪酸（saturated fatty acids，SFA）包括C12∶0、C14∶0、C16∶0、C18∶0，單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA）包括C16∶1、C18∶1、C20∶1，多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）包括C18∶2、C20∶2、C20∶4。

1.3.8 風味化合物的分離和鑒定

1.3.8.1 風味化合物的分離

分別取實驗組和對照組發酵末期的肉樣，密封后于－20℃保藏備用。測試前取20g鴨肉香腸，室溫下迅速剪成邊長為1～2mm的肉粒后立即裝于頂空萃取瓶中密封，備用。

萃取頭第一次使用時在氣相色譜進樣口老化2h，老化溫度為250℃，載氣體積流量為0.8mL/min，分流比為50∶1。將復合式75μm Car/PDMS萃取頭插入密封的萃取瓶，推出萃取頭，使纖維頭探伸至樣品上部，在60℃條件下萃取60min[14]，然后將萃取頭插入氣相色譜進樣口于250℃條件下解吸2min，抽回纖維頭后拔出萃取頭，同時啟動儀器采集數據。

1.3.8.2 風味化合物的鑒定

采用氣-質聯用儀（GC-MS）進行風味物質鑒定。

氣相色譜條件：毛細管色譜柱為DB-5MS（60m×0.32mm，1μm）；載氣為He，不分流，恒流12mL/min；進樣口溫度250℃，解析2min；程序升溫：起始溫度40℃保持1min，以50℃/min升至130℃，80℃/min升至200℃，12℃/min升至250℃，保持7min，GC與MS接口溫度為250℃[15]。

質譜條件：離子源為EI源，溫度為200℃，接口溫度為250℃，檢測器電壓350V，發射電流150μA，掃描范圍33～500amu。

定性：化合物經計算機檢索，與NIST library相匹配，相似指數800以上為確認化合物（最大值為1000）。

定量：相對百分含量按峰面積歸一化計算。

1.3.9 數據處理

使用Excel 2007和SPSS 17.0對數據進行分析和處理。

2 結果與分析

2.1 鴨肉香腸發酵過程中pH值的變化

圖1 鴨肉香腸發酵過程中pH值的變化Fig.1 Time-dependent changes in pH value during the process of fermented duck sausage

由圖1可知，香腸發酵和成熟過程中，各處理組pH值下降主要發生在48h內。發酵2d，S2處理組和L2處理組的pH值均極顯著低于對照組（P＜0.01），這是由于乳酸菌大量增殖，分解腸餡中的碳水化合物，產生大量乳酸和少量醋酸，使pH值降低[16]，48h以內pH值降到5.3以下是發酵香腸安全控制的關鍵因素[17-18]。另外，低pH值還可促使亞硝酸鹽分解，減少亞硝酸胺的生成[19]。發酵期第2天，S2處理組的pH值顯著低于L2處理組（P＜0.05），這說明凍干菌粉發酵產酸能力較強，保持了乳酸菌（植物乳桿菌）的發酵產酸活性。后期由于乳酸發酵可能會使pH值降低，或者蛋白降解產生胺類物質又會使pH值升高，最后香腸干燥成熟時（29d），S2處理組和L2處理組pH值差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 鴨肉香腸發酵過程中水分含量的變化

圖2 鴨肉香腸發酵過程中水分含量的變化Fig.2 Time-dependent changes in moisture content during the process of fermented duck sausage

由圖2可知，香腸發酵和成熟過程中，對照組、S2處理組和L2處理組水分含量均呈下降趨勢，從最初的55%左右降到30%左右。LSD多重比較分析可得，香腸發酵前期（0～13d），三者的水分含量無顯著性差異（P＞0.05），香腸干燥后期（17～21d），S2處理組和L2處理組的水分含量顯著低于對照組（P＜0.05），說明添加凍干發酵劑和液體發酵劑均能加速香腸的干燥脫水，但二者作用效果差異不顯著。

2.3 鴨肉香腸發酵過程中水分活度的變化

圖3 鴨肉香腸生產過程中水分活度變化Fig.3 Time-dependent changes in water activity during the process of fermented duck sausage

由圖3可知，各處理組水分活度最初均在0.915左右，在發酵和成熟期間，隨著香腸水分含量的降低，對照組、L2處理組和S2處理組的水分活度均呈逐漸下降趨勢，發酵的前10d下降較緩慢，13d之后下降較快，且L2處理組和S2處理組aw值始終略低于對照組，原因可能是接種植物乳桿菌的香腸在發酵和成熟期間pH值始終低于對照組，從而導致香腸的持水力降低，水分活度是香腸安全性保障的主要指標，水分活度的下降速度對產品安全性和保藏性具有重要貢獻作用。

2.4 鴨肉香腸最終產品的質構分析結果

香腸在發酵和成熟過程中，隨著pH值和水分含量的變化，其力學特性指標（硬度、彈性、咀嚼性、膠黏性）也發生相應變化。由表1可知，在香腸發酵成熟末期，除咀嚼性外，L2處理組和S2處理組的指標之間差異均不顯著（P＞0.05），L2處理組和S2處理組的香腸硬度、彈性和咀嚼性均顯著（P＜0.05）高于對照組，有可能是由于乳酸菌的發酵作用，導致pH值的降低，低pH值使香腸蛋白質變性，蛋白質的變性和凝固降低了香腸的持水力，從而使香腸的結構更致密。

表1 不同發酵劑發酵香腸質構分析結果Table 1 TPA parameters of fermented sausage from different starters

2.5 鴨肉香腸發酵過程中酸價的變化

圖4 鴨肉香腸發酵過程中酸價的變化Fig.4 Time-dependent changes in acid value during the process of fermented duck sausage

發酵香腸在成熟過程中脂肪會在脂酶的作用下發生水解，生成游離脂肪酸和低一級的甘油脂，從而造成酸價的變化，脂酶主要有兩個來源，內源脂酶和微生物脂酶[20]。由圖4可知，對照組、L2處理組和S2處理組的酸價均呈逐漸上升趨勢，1～5d之間酸價上升速率較快，后期干燥期（13～21d）酸價上升較慢，這是因為發酵期的溫度和pH值都較高，脂酶的活性較強，而成熟期的pH值較低，脂酶的活性受到一定抑制，所以酸價的上升主要在香腸發酵階段。由LSD多重分析可知，香腸發酵成熟過程中，L2處理組、S2處理組與對照組酸價差異不顯著（P＞0.05），這說明在脂肪氧化過程中，內源性脂酶可能比發酵劑產生的脂酶發揮的作用更大，內源脂酶是影響脂質分解的關鍵因素。

2.6 鴨肉香腸發酵過程中POV值的變化

圖5 鴨肉香腸發酵過程中POV值的變化Fig.5 Time-dependent changes in POV value during the process of fermented duck sausage

由圖5可知，在香腸發酵和成熟期間，3個處理組的POV值變化趨勢基本一致，先上升后下降，達到最低后又緩慢上升。這種變化趨勢可能是由工藝參數的改變造成的，脂酶的活性與香腸的溫度和pH值有關，香腸發酵前期，溫度較高，脂肪氧化速率快，在成熟期間溫度降低，脂肪氧化速率也有所減慢，過氧化物形成的速率小于過氧化物進一步氧化的速率，導致POV值下降。之后溫度變化幅度不大，隨著時間的延長，過氧化物逐漸積累導致過氧化物值升高。由LSD多重分析可知，不同處理條件對香腸POV值無顯著性影響（P＞0.05），這與酸價的測定結果一致。第2天時POV值最大，L2處理組POV值顯著低于對照組（P＜0.05），S2處理組POV值與對照組差異不顯著（P＞0.05）；第17天時POV值最小，S2處理組POV值顯著高于對照組（P＜0.05），L2處理組POV值與對照組差異不顯著（P＞0.05）。

2.7 鴨肉香腸發酵成熟后脂肪酸的含量

在發酵肉制品生產過程中，脂質物質經歷了水解、氧化以及一級氧化產物與其他成分進一步的相互作用等變化過程。相對于未水解的甘油酯和磷脂，水解形成游離脂肪酸使脂質更易發生氧化作用，從而導致大量風味物質的形成[21]。所以研究各種游離脂肪酸變化情況是研究風味形成機制的基礎。不同處理組產品中游離脂肪酸的含量見表2。

表2 不同處理發酵香腸脂肪酸的含量Table 2 Contents of free fatty acids in different samples mg/100g

由表2可知，對照組游離脂肪酸的總量為647.22mg/100g，L2處理組游離脂肪酸的總量為818.46mg/100g，S2處理組游離脂肪酸的總量為731.09mg/100g，顯示添加發酵劑的實驗組游離脂肪酸總量顯著性增加（P＜0.05），初步說明微生物發酵劑促進了香腸中游離脂肪酸的釋放。從脂肪酸的組成來看，鴨肉發酵香腸中飽和游離脂肪酸有C14∶0、C16∶0、C18∶0和C17∶0，單不飽和脂肪酸有C16∶1和C18∶1，多不飽和脂肪酸有C18∶2和C20∶4。由統計分析得出，L2處理組、S2處理組的C18∶1與對照組無顯著性差異（P＞0.05），其余游離脂肪酸經不同處理組處理均存在顯著性差異（P＜0.05）；比較L2處理組和S2處理組可知，兩者所含C16∶1、C18∶1、C18∶2和C20∶4等不飽和脂肪酸含量均無顯著性差異（P＞0.05），而兩者所含C14∶0、C16∶0、C17∶0和C18∶0等飽和脂肪酸含量存在顯著性差異（P＜0.05）。對照組、L2處理組和S2處理組游離脂肪酸的組成相同，說明微生物發酵劑的添加沒有改變發酵香腸在成熟過程中脂肪的降解方式[22]。

表2還顯示了不同處理組中不同類型的游離脂肪酸的含量，鴨肉發酵香腸產品各類型脂肪酸占總游離脂肪酸的比例為：SFA＞MUFA＞PUFA，即鴨肉香腸發酵成熟后，總游離脂肪酸中含量最豐富的是SFA，其次是MUFA，PUFA含量最少。香腸發酵成熟過程中，其長鏈脂肪酸的水平保持在一個動態平衡狀態，即由脂肪水解產生的長鏈脂肪酸的量和長鏈脂肪酸降解為低級化合物的量處于一個動態平衡中[23]，L2處理組和S2處理組的SFA含量顯著高于對照組（P＜0.05）；L2處理組和S2處理組的MUFA含量無顯著性差異（P＞0.05）；3個處理組的PUFA含量均無顯著性差異（P＞0.05），且在總游離脂肪酸中相對含量最低，原因是多不飽和脂肪酸進一步的氧化程度較高，氧化易生成醛、酮等羰基風味化合物。

2.8 香腸成熟過程中揮發性風味物質分析

表3 鴨肉香腸中揮發性風味物質的相對含量Table 3 Relative contents of volatile flavor compounds in fermented duck saussaaggeess

續表3

由表3可知，鴨肉香腸發酵29d相對含量在0.2%以上的風味物質共檢出43種，其中醛類10種，烴類12種，酸類3種，酯類5種，酮類2種，醇類8種，醚類1種。對照組共檢測到32種揮發性風味物質，其中醛類10種，烴類8種，酸類1種，酯類4種，酮類1種，醇類6種。L2處理組共檢測到20種揮發性風味物質，其中醛類8種，烴類4種，醇類3種，酯類1種，酮類2種。S2處理組共檢測到26種揮發性風味物質，其中醛類8種，烴類6種，酸類2種，醇類5種，酯類3種。

鴨肉香腸發酵29d各處理組揮發性風味物質相對含量比較豐富的是醛類、其次是烴類，再其次是醇和酯。L2處理組和S2處理組醛類物質都檢出8種，2-十一碳烯醛和2-溴十八醛均未檢出（對照組有檢出），推測可能與接種的發酵劑有關，具體機理有待進一步深入研究，但是醛類總相對含量仍高于對照組，其中乙醛是風味主要貢獻物質，占醛類總量的20.12%和22.11%。L2處理組和S2處理組酯類物質含量豐富，分別為4.27%和4.96%。對照組烴類物質含量較高，是主要風味成分之一，相對含量為7.61%。

3 結論與討論

高效濃縮型凍干發酵劑不需要經過菌種活化直接可以應用于生產，使用方便，接種量小，活菌含量高，實驗中所使用的濃縮型凍干發酵劑活菌濃度為1011CFU/g，這是對發酵液進行濃縮10倍收集菌體，實際應用中，可根據具體情況選擇濃縮倍數。

香腸發酵過程中的pH值、水分含量以及水分活度是反映凍干發酵劑能否起到發酵作用的重要指標，研究表明，接種凍干發酵劑的香腸48h以內快速發酵產酸達到發酵香腸安全控制范圍；香腸干燥成熟時處理組的水分含量呈下降趨勢，最終降到30%左右，低水分含量也起到抑菌防腐的作用。本實驗中除了對比濃縮型凍干發酵劑與液體發酵劑、自然發酵的發酵特性之外，還將各處理組香腸的質構進行分析比較，L2處理組、S2處理組的硬度、彈性和咀嚼性均顯著（P＜0.05）高于對照組，表明凍干發酵劑處理對鴨肉香腸的質構品質有較強的影響與促進作用。

此外，本實驗還探討了發酵劑對香腸中脂肪氧化和分解過程的作用，微生物酶和肉自身脂酶共同作用參與脂肪的降解過程，對香腸中脂肪酸的釋放產生了一定的影響，大量的脂肪酸釋放出來，進一步轉化形成了甲基酮和醛，為肉制品提供了獨特的風味[24]。目前研究證明，微生物脂酶和內源脂酶是影響脂肪分解的主要因素，Naes等[25]研究了一種來自植物乳桿菌的脂酶，他們發現這種酶能使脂肪酸的組成發生重要的變化，使十八碳的脂肪酸發生了較高程度的斷裂。蔡華珍等[26]研究廣式香腸在烘烤過程中游離脂肪酸的變化時指出脂肪酸的釋放速率為：亞油酸＞油酸＞棕櫚油酸＞硬脂酸＞棕櫚酸，但具體的脂肪酸斷裂與釋放機制仍需進一步研究。

過氧化物是脂質氧化過程的中間產物，通過測定脂肪中過氧化物的量，可以評價脂肪的氧化程度，研究表明肉樣中的不飽和脂肪酸直接加氫形成過氧化物，而飽和脂肪酸通過β-氧化生成酮、酸。本實驗通過測定接種發酵劑的發酵香腸的酸價和POV值發現，脂肪發生劇烈降解，產生大量游離脂肪酸，但S2處理組、L2處理組和對照組之間差異不顯著（P＞0.05），說明植物乳桿菌對脂類物質分解能力不強，初步得出內源脂酶是導致脂質分解的關鍵因素，這與Talon等[27]的研究結果一致。

鴨肉香腸發酵成熟后，各類型脂肪酸占總游離脂肪酸的比重為：飽和脂肪酸＞單不飽和脂肪酸＞多不飽和脂肪酸，接種發酵劑的L2處理組和S2處理組FFA總量顯著高于對照組（P＜0.05）。其中棕櫚酸（C16∶0）和油酸（C18∶1）含量顯著高于其他脂肪酸（P＜0.05），十七烷酸（C17∶0）含量最低（P＜0.05），且肉豆蔻酸（C14∶0）只在L2處理組和S2處理組中檢出，說明發酵劑的添加對游離脂肪酸的釋放起到一定促進作用，在一定程度上豐富了香腸風味的前提物質。

最后，通過香腸成熟過程中揮發性風味物質分析，凍干發酵劑處理組共檢測到26種揮發性風味物質，其中醛類8種，烴類6種，酸類2種，醇類5種，酯類3種，能夠提供良好的風味，與液體發酵劑和自然發酵均有顯著區別，為凍干發酵劑在肉制品中的實際生產應用提供了一定的研究基礎。

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