HPLC法同時測定大鼠CYP2B、2C、2E酶活性及其應用

代 晶,呂紅霞,王麗聰,涂碎萍,吳 丹

（成都醫學院藥學院，四川 成都 610081）

HPLC法同時測定大鼠CYP2B、2C、2E酶活性及其應用

代 晶,呂紅霞,王麗聰,涂碎萍,吳 丹

（成都醫學院藥學院，四川 成都 610081）

建立同時測定大鼠肝微粒體中CYP2B、2C、2E酶活性的HPLC法，并用該方法評價氯胺酮對這3種酶的影響。以鹽酸安非他酮、甲苯磺丁脲、氯唑沙宗作為CYP2B、CYP2C、CYP2E的特異性底物。以非那西丁為內標，色譜柱為Welchrom C18，流動相為甲醇：0.01mol/L乙酸銨（pH 5.0）=55∶45，流速為1mL/min，檢測波長為220，247，250，280nm，柱溫為30℃，進樣量為40μL。體外孵育反應的蛋白濃度為3.75mg/mL，孵育時間為30min。采用上述方法測定3種底物在對照組和氯胺酮給藥組中的代謝速率，結果顯示，各底物在線性范圍內線性關系良好，相關系數r＞0.9991；日內RSD＜12.1%，日間RSD＜12.5%；方法回收率為84.4%～114.3%，提取回收率為93.65%～100.7%。本方法靈敏、準確、簡單，可用于大鼠肝微粒體中CYP2B、2C、2E酶活性的測定。

CYP2B；CYP2C；CYP2E；高效液相色譜法；肝微粒體；氯胺酮

0 引 言

CYP2酶是CYP450家族中重要的超家族酶系之一，主要包括CYP2B、2C和2E酶等，在人肝臟中約占CYP450總含量35%，參與代謝活化及失活多種臨床藥物、前毒物和前致癌物[1-2]。研究表明CYP2酶個體含量差異大，遺傳基因具有高度多態性，如CYP2B和CYP2E含量差異分別可達250倍[3]和50倍[4]，CYP2C有30多種等位基因的突變體[5]。這些特點導

致代謝酶活性存在差異，是藥物代謝的種族和個體差異的重要原因之一。因此，分析藥物與CYP2酶的關系對于臨床合理用藥有著重要意義。鹽酸安非他酮、甲苯磺丁脲和氯唑沙宗分別是CYP2B、2C和2E酶的特異性底物，被廣泛選作底物用于體內外測定酶活性[6]。本試驗通過篩選前處理和色譜方法，優化樣品孵育條件，建立一種可以同時測定大鼠肝微粒體中CYP2B、2C和2E酶底物的HPLC法，為測定上述酶活性以及研究藥物對其活性的影響提供簡單、可靠的方法學基礎。同時，應用所建立的方法評價氯胺酮對CYP2B、2C和2E酶的影響。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

儀器：高效液相色譜儀（美國Dionex公司），包括P680泵、ASI-100自動進樣器、UV1700型檢測器，TC100柱溫箱，Chomeleon工作站。

試劑：甲苯磺丁脲（批號1001083283）購自美國Sigma-Aldrich公司；氯唑沙宗、非那西丁（批號100364-200301、100095-198904）購自中國藥品生物制品鑒定所；鹽酸安非他酮（批號1112001，純度＞98%）購自漢江萬全醫藥化工有限公司；氯胺酮注射液（批號100819，規格100mg∶2mL）購自福建古田藥業有限公司。還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）購自美國Los Angeles公司；甲醇（色譜純）購自美國Dikma公司，其余試劑均為分析純。

動物：健康成年的SD大鼠16只，雄性，體重250～300g。購自四川大學華西實驗動物中心，合格證號SYXK（川）2008-113。

1.2 實驗方法

（1）溶液的配制。分別取鹽酸安非他酮、甲苯磺丁脲和氯唑沙宗對照品適量，用甲醇稀釋成系列濃度的對照品溶液，其中鹽酸安非他酮和甲苯磺丁脲的濃度分別為5，10，20，50，100，200，500，1 000 μmol/L；氯唑沙宗的濃度分別為4，10，20，40，100，200，400，800μmol/L。取非那西丁（內標）對照品適量，用甲醇稀釋成濃度為500μmol/L的溶液。上述溶液置4℃冰箱，備用。

（2）動物實驗和肝微粒體的制備。參考文獻[7]的方法，將大鼠隨機分為氯胺酮給藥組和對照組，每組8只。給藥組大鼠按10mg/kg/d氯胺酮生理鹽水溶液灌胃給藥，連續10d。對照組大鼠按同等劑量生理鹽水灌胃給藥，連續10d。在第11d，處死大鼠。采用鈣離子沉淀法制備肝微粒，Bradford法測定蛋白濃度。

（3）色譜條件。流動相為甲醇：0.01mol/L乙酸銨（pH 3.0、4.0、5.0、6.0）=55∶45；色譜柱為Welchrom C18柱（4.6mm×250mm×5μm）；非那西丁、鹽酸安非他酮、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲的檢測波長分別為247，250，280，220nm；柱溫為30℃；體積流量為1.0mL/min。

（4）前處理方法。方法一：取0.5mL樣品溶液，加入2.0mL甲醇和10μL內標溶液，渦旋混合3 min后，12000r/min離心10min，取出上清液于50℃氮氣流下吹干，殘留物用200μL流動相溶解，13500r/min離心10min，取出上清液，取40μL進樣分析。

方法二：取0.5 mL樣品溶液，加入1.0 mol/L HCl 50μL，再加入2.0mL甲醇和10μL內標溶液，其余操作參照“方法一”進行處理。

（5）分析方法的驗證。本試驗對HPLC法進行了系統適用性、線性、定量下限、精密度、回收率、穩定性的驗證。

（6）孵育條件的優化。測定不同反應時間（10，20，30，45，60min）和不同蛋白濃度（1.0，1.5，2.0，2.5，3.75，5.0mg/mL）條件下底物的含量。取鹽酸安非他酮、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲對照品溶液，揮干溶劑，加入肝微粒體溶液和Tirs-HCl（0.1mol/L，pH 7.4）溶液適量，于37℃水浴預熱3min后，加入NADPH啟動反應。反應終體積為0.5 mL，NADPH的終濃度為1 mmol/L，鹽酸安非他酮、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲的終濃度為50，40，50μmoL/L，于不同時間和不同蛋白濃度下反應。反應結束后，將樣品取出，置于冰浴中，參照（3）和（4）項下方法進行處理分析。

2 結果與討論

2.1 色譜條件

試驗顯示在pH為3.0～6.0范圍內，非那西丁、氯唑沙宗的保留時間幾乎不受影響，而鹽酸安非他酮的保留時間隨pH的增加而增大，甲苯磺丁脲隨pH的增大而減小。這主要是由于安非他和甲苯磺丁脲酮分別是堿性和酸性化合物，兩者在不同pH條件下解離情況不同，色譜行為不同。而當pH達到5.0時，各待測物達基線分離，內源性物質不受干擾，整個分析周期小于15min，試驗條件能夠滿足樣品測定的需要。故本試驗選擇為甲醇-0.01 mol/L乙酸銨（55∶45，v/v，pH=5.0±0.02）作為流動相。

2.2 前處理方法

試驗發現樣品經“方法一”處理后，甲苯磺丁脲、氯唑沙宗均具有較高提取回收率（＞95%），但鹽酸安非他酮的回收率不足30%。而經過“方法二”處理后，3個底物的提取回收率均大于93%。故試驗選擇“方法二”做為前處理方法。游離的安非他酮穩定性較差，易揮發，而安非他酮的鹽酸鹽（pKa=7.9）較為穩定[8]。本試驗樣品溶液的pH為7.4，經甲醇沉淀蛋

白后，上清液呈堿性（pH 8.0～8.5），揮干溶劑時會造成安非他酮的損失。因此方法二在沉淀蛋白前加入鹽酸，能使游離的安非他酮轉化為鹽酸鹽，增加其穩定性，提高回收率。本試驗曾用高氯酸直接沉淀蛋白，發現有雜質干擾測定，而且甲苯磺丁脲為磺酰脲類化合物，能夠在強酸條件下水解[9]，故不適合用該法處理樣品。

2.3 分析方法驗證

2.3.1 系統適用性試驗

取大鼠的空白肝微粒體溶液、空白肝微粒體加各探針底物和內標溶液，探針底物肝微粒體孵育30min后的樣品溶液，進行處理和測定，結果（見圖1）顯示，在此條件下，各探針藥物達基線分離，內源性物質不干擾測定。

2.3.2 線性關系及定量限

精密量取底物對照品溶液各50 μL，制備系列濃度的質控樣品溶液（n=3），按建立的方法進行處理和測定，以待測物濃度為橫坐標，待測物與內標物的峰面積比值為縱坐標進行線性回歸，同時以信噪比≥10計算定量下限（LLOQ）。結果顯示：鹽酸安非他酮、甲苯磺丁脲和氯唑沙宗分別在0.5～100，0.5～100，0.4～80 μmol/L范圍內線性關系良好，對應的回歸方程分別為Y=0.0979X+0.0030（r=0.9999），Y=0.0622X-0.000 5（r=0.999 8），Y=0.0342X-0.011 1（r=0.9991）。定量下限依次為0.5，0.5，0.4μmol/L。

2.3.3 精密度試驗和回收率試驗

制備低、中、高3個濃度的質控樣品溶液（n=6）。按建立的方法在1d內進樣分析，計算日內精密度，連續測定3d，計算日間精密度。將測得的待測物與內標峰面積之比代入回歸方程，計算方法回收率。取同等濃度的各待測物和內標的對照品溶液，直接揮干溶劑，流動相溶解后進樣分析，將樣品中各待測物的峰面積與對照品峰面積進行比較，計算提取回收率，結果見表1。

2.3.4 穩定性試驗

參照“2.3.3”項下方法，制備低、中、高3個濃度的質控樣品溶液，分別置于室溫和-20℃冰箱中。置于室溫的樣品分別于24h和48h后進行測定，結果

RSD%＜7.9%。置于-20℃冰箱中的樣品分別于3d和7d后測定，結果RSD%＜12.9%。表明各探針底物在室溫48h內穩定，在-20℃冰箱7d內穩定。

2.4 孵育條件優化

試驗顯示，隨著時間的延長和蛋白濃度的增大，底物消耗增加，反應30min后不再變化。由于在進行酶動力學研究時，要求底物減少速率與微粒體蛋白濃度和孵育時間呈線性關系。蛋白濃度過高時，非特異性結合將影響底物的反應，進而影響酶動力學的評價[10]。同時考慮底物減少盡可能的多，因此，本試驗選擇蛋白濃度為3.75 mg/mL、反應時間為30 min作為最佳反應條件。

2.5 氯胺酮對CYP2B、2C、2E酶的影響

在上述條件下，比較各底物在氯胺酮給藥組和對照組的代謝速率（（底物的初始量-底物的剩余量）/孵育時間/肝微粒體蛋白質質量，單位為pmol/min/mg）。結果鹽酸安非他酮、甲苯磺丁脲和氯唑沙宗在給藥組的代謝速率分別為 41.0±10.1、32.3±12.5、78.1± 12.1 pmol/min/mg；在對照組的代謝速率為 25.7± 5.3，23.7±9.6，70.5±23.3pmol/min/mg。數據經T檢驗顯示，鹽酸安非他酮的代謝速率有顯著性差異（P＜0.05），而甲苯磺丁脲和氯唑沙宗無顯著性差異，表明氯胺酮對CYP2B有誘導作用，而對CYP2C和2E無顯著影響。

前期研究發現，在CYP2系列酶中，只有CYP2B參與了氯胺酮在大鼠肝微粒體中N-去甲基的代謝反應，而CYP2C、2E等未參與代謝[11]。該結果與本試驗結果一致，也進一步印證了氯胺酮在體內主要與CYP2B存在相互作用，而與CYP2C和2E無相互影響。

3 結束語

目前，針對CYP2B、2C和2E酶活性測定方法主要有熒光法[7，12]、LC/MS法[13-14]等。熒光法底物昂貴，每個分析周期只能測定一種酶活性；而LC/MS方法雖然靈敏、準確，可以同時測定多種酶活性，但其檢測費用較貴，儀器普及性不高，對樣品處理和流動相等要求較嚴格。相較于上述方法，本試驗選擇的探針底物較為常見，前處理方法簡單，檢測儀器普及性高，可以同時測定3種酶的活性，故本方法具有一定優勢。應用該方法研究氯胺酮對CYP2酶活性的影響時，其結果與前期研究結果一致[7，11]。綜上表明，本研究建立的方法準確、可靠，可用于CYP2系列酶活性的評價，也可為一些經CYP2系列酶代謝藥物的代謝及與其他藥物的相互作用的研究提供參考方法。

[1]Marcella M，Geny G M M，Ruben D K.Species differences between mouse,rat,dog,monkey and human CYP-mediated drug metabolism,inhibition and induction[J]. Expert Opin Drug Metab Toxicol，2006，2（6）：875-894.

[2]段曉紅，周宏灝.細胞色素氧化酶CYP2C9的誘導機制及研究進展[J].中國藥理學通報，2004，20（9）：961-965.

[3]Code E L，Crespi C L，Penman B W，et al.Human cytochromeP4502B6：interindividual hepatic expression, substrate specificity，and role in procarcinogen activation[J]. Drug Metab Dispos，1997，25（8）：985-993.

[4]斌巴，閆少鋒，蘇秀蘭.細胞色素p4502E1遺傳多態性的研究進展[J].中華腫瘤防治雜志，2009，16（4）：315-319.

[5]李智，王果，周宏灝.CYP2C9基因多態性及其功能意義研究進展[J].中國臨床藥理學與治療學，2008，13（6）：601-609.

[6]曾蘇.藥物代謝學[M].杭州：浙江大學出版社，2008：190-195.

[7]代晶，楊萬清，廖林川.氯胺酮多次給藥對大鼠肝微粒體內細胞色素P450_2B酶的誘導作用[J].成都醫學院學報，2012，79（3）：383-385.

[8]Loboz K K，Gross A S，Ray J，et al.HPLC assay for bupropion and its major metabolites in human plasma[J]. J Chromatogr，2005，823（2）：115-121.

[9]尤啟東.藥物化學[M].7版.北京：人民衛生出版社，2013：388-390.

[10]Bjornsson T D，Callaghan J T，Einolf H J，et al.The conduct of in vitro and in vivo drug-drug interaction studies:a pharmaceutical research and manufacturers of America（PhRMA）perspective[J].Drug Metab Dispos，2003，31（7）：815-832.

[11]代晶，廖林川.CYP450在大鼠肝內氯胺酮N-去甲基代謝中的作用[J].中國法醫學雜志，2012，27（3）：190-193.

[12]張沂，于春令，邸秀珍，等.氟喹諾酮類藥物對大鼠肝微粒體細胞色素P450酶系的影響[J].解放軍醫學雜志，2012，37（11）：1059-1063.

[13]Alden P G，Plumb R S，Jones M D，et al.A rapid ultra-performance liquid chromatography/tandem mass spectrometric methodology for the in vitro analysis of Pooled and Cocktail cytochrome P450 assays[J].Rapid Commun Mass Spectrom，2010，24（1）：147-154.

[14]Kim M J，Kim H，Cha I J，et al.High-throughput screening ofinhibitory potentialofnine cytochrome P450 enzymes in vitro using liquid chromatography/tandem mass spectrometry[J].Rapid Commun Mass Spectrom，2005，19（18）：2651-2658.

Determination of CYP2B,2C,2E activities by high performance liquid chromatography and its application

DAI Jing，Lü Hong-xia，WANG Li-cong，TU Sui-ping，WU Dan
（School of Pharmacy，Chengdu Medical College，Chengdu 610081，China）

The HPLC method was established to determine CYP2B，2C，2E activities in rat liver microsome.And the effect of ketamine on CYP2B，2C，2E was evaluated.Bupropion，tolbutamide and chlorzoxazone were employed asthe substratesofCYP2B，2C，2E，respectively.The determination was performed on Welchrome C18 column with phenacetin as an internal standard. The mobile phase was methanol：0.01mol/L ammonium acetate（pH 5.0）=55∶45.The detection wavelengths were set at 220，247，250，280 nm，the column temperature was 30℃ and the injection volume was 40 μL.The substrates’metabolic velocities after incubating with 3.75 mg/mL of liver microsomes for 30min were determined from the control group and the ketamine group.The results showed that the substrates were linearity within their linearity ranges with the correlation coefficients greater than 0.9991.The intra-and inter-assay precisions of CYPs substrates were less than 12.1% and 12.5%，the assay recoveries were between 84.4%and 114.3%，and the extract recoveries were 93.65%-100.7%.This method is simple，sensitive，accurate and suitable for determining CYP2B，2C，2E activities in rat liver microsome in vitro.

CYP2B；CYP2C；CYP2E；HPLC；liver microsome；ketamine

O657.7+2；Q554；R965.2；R971+.2

：A

：1674-5124（2014）04-0063-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2014.04.016

2014-03-04；

：2014-04-21

四川省教育廳理科重點項目（12ZA026）

代 晶（1979-），女，吉林省吉林市人，講師，博士，主要從事藥物分析與藥代動力學研究。