Tween-60協同微波提取桑椹總黃酮的研究

韓 偉 徐劍宇 方若舟 黃伯駿

（華東理工大學中藥現代化工程中心，上海200237）

0 引言

桑葚，又名桑葚子、桑實、黑葚、桑果，為桑科植物桑的果穗。我國的桑樹種類以及桑葚產量均居世界首位，曬干或蒸后曬干即可作為中藥材原料。桑椹中含有豐富的黃酮類化合物，如蘆丁、花青素等，佟繼銘等研究發現總黃酮有較好的抗心律失常[1]和降低血壓[2]的作用，同時具有良好的抗衰老、抗潰瘍、抗病毒等作用[3]，醫用價值顯著。但到目前為止，對桑椹總黃酮提取工藝的報道還較為少見。

桑椹總黃酮傳統的提取方法為水提法，其提取率較低，高靜等[4]研究得到桑葚的提取率僅為0.24%。隨著中藥現代化進程的推進，超臨界提取、超聲波提取、微波輔助萃取等新技術迅速涌現[5～7]。

微波輔助提取（MAE）和表面活性劑輔助提取是近年來興起的新型提取技術，與傳統的提取方法相比，其具有快速、高效、節能[8]的優點。目前，微波萃取已廣泛應用于中草藥有效成分的提取中[9]。本文以桑葚為體系，采用表面活性劑輔助微波法提取桑椹總黃酮，通過正交實驗確定各因素的影響順序，并得出最佳的提取工藝條件。

1 實驗材料及方法

1.1 實驗材料、試劑與設備

藥材：桑葚1 kg/袋，上海華宇藥業有限公司生產。

試劑：蘆丁標準品（＞95%），中國藥品生物制品檢定所生產；實驗所用的其他試劑均為分析純。

儀器與設備：UV1900PC紫外分光光度計，上海亞研電子儀器科技有限公司生產；SHB-Ⅲ型循環水真空泵，鞏義市英峪予華儀器廠生產；JY5002電子天平，上海良平儀器儀表有限公司生產；SK3310HP超聲清洗儀，上海科導超聲儀器有限公司生產；ER-692微波提取裝置，中國電子器件工業有限公司生產。

1.2 實驗方法

實驗的具體方法：（1）將干燥的桑葚粉碎備用；（2）準確稱取桑葚粉3.00 g；（3）以一定比例加入去離子水；（4）加入一定量的表面活性劑；（5）微波處理供試液；（6）抽濾所得供試液；（7）顯色后測定供試液吸光度；（8）計算黃酮得率。

1.3 總黃酮分析方法的建立

本實驗利用黃酮類化合物在堿性條件下與A l3+形成穩定有色絡合物，且在紫外—可見光分光光度計500～515 nm波長范圍內有最大吸收的特性，采用中國藥典所收載的亞硝酸鈉—硝酸鋁—氫氧化鈉比色法[10]來測定黃酮的含量。

1.3.1 最大吸收波長的測定

1.3.1.1 溶液的配制

標準溶液：準確稱取0.0212g蘆丁標準品，溶于100m L的容量瓶中，得到0.212mg/m L的蘆丁標準品溶液。

供試品溶液：即經微波輔助提取后抽濾所得的濾液。

1.3.1.2 最大吸收波長的確定

吸取蘆丁標準溶液（0.212 mg/m L）及供試品溶液各2m L，分別置于25m L容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉試液1 m L，靜置6 m in；加入10%硝酸鋁試液1 m L，靜置6 min；加入4%氫氧化鈉試液10m L，并補加水至刻度，靜置15m in。之后以相應試劑作為空白對照，于紫外—可見光分光光度計400～650 nm波長范圍內進行掃描，結果如圖1所示。將供試品溶液稀釋到合適的倍數，作相同處理，于400～650 nm波長范圍內掃描，結果如圖2所示，確定最大吸收波長為500 nm。

圖1 蘆丁標準溶液的波長掃描結果

圖2 桑葚樣品溶液的波長掃描結果

1.3.2 蘆丁標準曲線的建立[11]

分別吸取蘆丁標準液（0.212 mg/m L）1 m L、2m L、3m L、4m L、5m L、6m L、7m L、8m L，各置于25m L量瓶中，按1.3.1.2所述的顯色方法顯色，以相應試劑作為空白對照組，使用紫外—可見光分光光度計在500 nm波長處測定吸光度。以測得的吸光度A為縱坐標，蘆丁濃度C（mg/m L）為橫坐標，繪制標準曲線（圖3），得標準曲線回歸方程為：A=11.877C－0.009，線性濃度范圍為0.008 6～0.068 5mg/m L，R2=0.999 7。可見A與濃度C之間呈良好的線性關系，可按標準曲線法進行定量分析。

圖3 蘆丁標準曲線圖

利用標準曲線回歸方程計算出供試品溶液中黃酮的濃度C（mg/m L），可根據下式計算總黃酮的得率：

式中C——樣品中黃酮的濃度，mg/m L；

V——溶劑量，m L；

M——桑葚的質量，g；

n——溶液稀釋倍數。

1.4 單因素實驗

分別考察表面活性劑的種類和濃度、液固比、微波輻射時間等因素對桑葚總黃酮得率的影響。

1.5 正交實驗

在單因素實驗的基礎上，選取對黃酮得率影響較大的因素進行正交實驗設計，其因素水平表如表1所示。

表1 正交實驗因素水平表L9（34）

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 表面活性劑的種類

圖4 為不同表面活性劑輔助提取桑葚總黃酮的實驗結果。由圖可知，Tween-60對微波提取的輔助作用為最優。Tween-60屬于水溶性表面活性劑，在水提過程中有良好的增溶作用，且其毒性較其他表面活性劑小，適于黃酮的提取，故選擇Tween-60作為表面活性劑進行后續實驗。

圖4 不同表面活性劑輔助提取桑葚總黃酮的實驗結果

2.1.2 表面活性劑濃度

圖5 為表面活性劑濃度對桑葚總黃酮的提取結果的影響，由圖可知，表面活性劑濃度在1.5 g/L時黃酮得率最高。當表面活性劑濃度較低時，增大表面活性劑用量可以顯著增加藥液體系中膠束的含量，從而大幅提升總黃酮的溶出率。但當膠束含量達到臨界值時，繼續增加表面活性劑用量不能形成有效的膠束，故其對于黃酮溶出率的影響變小甚至消失。而過多的表面活性劑會影響溶液整體的傳質與傳熱，阻礙桑葚總黃酮的溶出。所以，此種情況下的表面活性劑濃度以1.5 g/L為宜。

2.1.3 液固比

液固比對桑葚總黃酮的提取結果影響如圖6所示，可以看出，當液固比為40m L/g時，黃酮得率最高。這是因為在一定的范圍內增加液固比，將使藥材與溶劑之間的濃度差增大，傳質推動力增加，有利于黃酮的溶出；但液固比過大，溶劑吸收的微波能量也會增加，從而減少了藥材對能量的吸收，即溶液單位體積中藥材所獲得的微波能會相應減少，造成得率降低。故液固比取40m L/g為宜。

圖5 表面活性劑濃度對桑葚總黃酮的提取結果影響

2.1.4 微波輻射時間

圖7 為微波輻射時間對總黃酮提取結果的影響。由圖可知，微波輻射時間在180 s時黃酮得率最高。這是因為在一定范圍內增加微波時間，能使體系獲得更多的能量，加速桑葚細胞壁的破裂，使總黃酮易于溶出。當微波時間超過180 s后，由于微波劑量過大，部分黃酮可能因為微波加熱時間過長導致體系過熱而產生分解，使得率降低。故提取時間以180 s為宜。

圖6 液固比對桑葚總黃酮的提取結果影響

圖7 微波輻射時間對總黃酮提取結果的影響

2.2 正交實驗結果

在單因素實驗的基礎上，選取對黃酮得率影響較大的因素進行正交實驗設計，結果如表2所示。由表2直觀分析可知，當以黃酮得率為考察指標時，有A2＞A3＞A1，B2＞B3＞B1，C2＞C3＞C1，即各因素對桑葚總黃酮得率的影響程度依次為B＞A＞C，即液固比＞Tween-60濃度＞微波輻射時間；最優工藝條件為A2B2C2，即以水為溶劑，Tween-60作為表面活性劑，濃度為1.5 g/L，液固比取40m L/g，微波輻射時間180 s。經過重現性實驗可知，該工藝條件下總黃酮的得率穩定在2.051%左右。

表2 正交實驗結果

3 結語

本文以桑葚總黃酮的得率為指標，采用正交實驗法優選表面活性劑輔助微波提取工藝參數。結果表明，對總黃酮得率影響最大的因素為液固比，其次為Tween-60濃度、微波輻射時間。最優工藝條件為：以水為溶劑，Tween-60作為表面活性劑，濃度為1.5 g/L，液固比為40m L/g，微波時間為180 s，在該操作條件下，桑葚總黃酮的得率為2.051%，且穩定性良好。

［1］佟繼銘，符景春.黃芩莖葉總黃酮抗實驗性心律失常作用觀察［J］.承德醫學院學報，1991（3）

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［3］吳祖芳，翁佩芳.桑椹的營養組分與功能特性分析［J］.中國食品學報，2005（3）

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［8］駱健美，盧學英，張敏卿，等.微波萃取技術及其應用［J］.化工進展，2001（12）

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［11］唐紅軍.中國藥典2000年版一部檢測蘆丁含量方法的改進［J］.中國醫院藥學雜志，2002（1）