三 種 色 譜 前 處 理 方 法 的 比 較

陳明星， 關 妍， 潘 偉， 章 斐， 鄒 洪

(1.北京大學 化學與分子工程學院，北京 100871; 2.首都師范大學 化學系，北京 100048)

0 引 言

儀器分析教學中，理論和實際操作相結合的教學方法對于學生掌握各種分析測試技術和方法是非常重要的，當前，很多高校儀器分析理論教學多采用CAI(多媒體計算機輔助教學)的方式，將分析儀器的原理，構造等生動的表現出來[1-3]。除了理論教學以外，儀器分析實驗在整個儀器分析教學過程中占有很重要的位置，起到很重要的作用，儀器分析實驗的過程，也就是理論聯系實際的過程[4-7]。

在具體實施過程中如何讓學生深入的理解和掌握課堂上的理論知識，答案是顯而易見的，那就是：設計出一種合適的實驗教學方法。

色譜技術是生命科學、材料科學、環境科學等必不可少的手段和工具。根據最近的統計在全世界各類分析儀器中氣相色譜儀和液相色譜儀的營銷總額占25%～30%[8],色譜分析的全過程主要包括三個步驟：樣品的采集處理、樣品中各組分的分離測定、樣品測定后數據的處理與結果的表達。其中樣品的采集處理步驟是一個非常重要的和復雜的過程。據統計，在大部分色譜分析實驗室中，樣品的前處理所占用的時間占分析測試過程總時間的60%～70%，而色譜儀器測定分析樣品的時間只約占10%，其余的時間是用于樣品測定結果的整理和分析等[9]。而且樣品前處理的好壞直接影響到后續的測試結果，因此，樣品前處理這一項在色譜的實驗教學過程中是絕對不能忽略的。

在工作中以及經過調研后發現，受色譜教學實驗條件以及時間等因素的限制，目前本科生色譜實驗教學過程偏重于分離、儀器操作和數據處理方面的練習[10-14]，沒有涉及到前處理這一項，從而使得學生只有理論知識，缺乏實際操作經驗。造成學生對色譜前處理概念淡薄，重視程度不夠，還有相當一部分學生不知道如何去進行樣品前處理。為了解決這個問題，有必要開發建立一種包含色譜前處理技術并適合教學的實驗方法。

常用的色譜前處理方法包括溶劑萃取(液液萃取、液固萃取、液氣萃取)、蒸餾、固相萃取、微萃取(固相微萃取、液相微萃取、毛細管固相微萃取)、超臨界流體萃取、衍生化技術、微波萃取等。其中，溶劑萃取和固相萃取方法重現性好，易于操作，被采用的最多，也最為普及。微萃取技術，尤其是固相微萃取以其操作簡單，樣品用量少、無需使用溶劑、萃取后可直接色譜進樣等諸多優點，發展很快，但是由于重現性相對較差，設備裝置價格比較昂貴，成本較高，尚未普及。而超臨界流體萃取、衍生化技術和微波萃取等前處理方法主要針對于一些特殊樣品，不適合用于本科生教學實驗。

本實驗從本科生實驗教學角度出發，利用液液萃取、固相萃取、液相微萃取三種常見前處理方法，以水中的鄰苯二甲酸酯類物質為研究對象，結合氣相色譜-質譜聯用儀，考察了影響萃取效果的主要因素，優化了萃取條件，對三種常用的色譜前處理方法的處理效果以及特點進行了比較研究。

鄰苯二甲酸酯，又稱酞酸酯，縮寫PAEs，是鄰苯二甲酸形成的酯的統稱。常用作增塑劑和軟化劑，PAEs與塑料本身很難牢固結合，很容易從中溶解出來，從而進入環境。也是環境激素類物質[15],含較弱的雌性荷爾蒙活性成分，在人和動物體內起著類似雌性激素的作用，可導致內分泌紊亂、生殖機能失常等，過多地暴露在PAEs 中可能會導致男性比例下降、女性早熟以及乳腺癌[16]。水中PAEs主要來源于生產和使用PAEs的工廠,農用塑料薄膜、驅蟲劑及塑料垃圾等經雨水淋洗、土壤浸潤等,也會導致PAEs進入水體[17]。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

Agilent 7890A/5975C氣相色譜質譜聯用儀(DB-5MS 30 m×0.32 mm i.d.×0.25 μm石英毛細管柱)，Agilent BondElut Plexa C18固相萃取小柱(3 mL，200 mg)，VORTEX-GENIE2震蕩混合器，Merk MILIPORE MILIQ-A超純水機，SUPELCO 12位固相萃取裝置，八方世紀BF-2000氮氣吹干儀。

1.2 主要試劑與材料

鄰苯二甲酸二甲酯(DMP) ，鄰苯二甲酸二乙酯(DEP) ，鄰苯二甲酸二丁酯(DBP) ，鄰苯二甲酸二異丁酯(DIBP) ，鄰苯二甲酸丁基芐基酯(BBP) ，鄰苯二甲酸雙(2-乙基己基) 酯(DEHP) ，均購自百靈威公司；甲醇、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯均為一級色譜純。

實驗中使用的所有玻璃器具，為了避免實驗室內空氣中鄰苯二甲酸酯的污染，將器具在預先配置的鉻酸洗液中浸泡數小時，蒸餾水洗凈，再用色譜純甲醇淋洗3遍后在烘箱中以100 ℃烘烤5 h，實驗過程中不使用塑料制品。

1.3 實驗條件

1.3.1儀器條件

色譜條件：進樣口溫度280 ℃；傳輸線接口溫度：280 ℃；程序升溫：80 ℃(1 min)-10 ℃/min-320 ℃(5 min)；質譜條件：選擇離子(SIM)掃描模式；質量數掃描范圍：10～500 amu；離子源溫度：230 ℃；四級桿溫度150 ℃。

1.3.2標準溶液的配置

準確稱取DMP，DEP，DIBP，DBP，BBP,DEHP,DNOP各5 mg，分別用甲醇溶液溶解在5 mL的容量瓶中，配成1 mg/mL的單標儲備液。

準確移取上述6種單標儲備液各1 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成0.1 mg/mL的混合標準儲備液，置于冰箱中保存備用。

將以上配好的混標稀釋成0.05、0.02、0.01、0.002、0.001,0.000 5、0.000 25、0.000 125、0.000 01 mg/mL，進行儀器分析，繪制標準曲線。

1.3.3空白添加

取配好的混標溶液1 mL，放入1 000 mL容量瓶中，用超純水稀釋至刻度，搖勻密封冷藏待用。

1.3.4液相微萃取

用氣相色譜專用微量注射器(Agilent 10 μL)吸取1 μL正己烷，插入裝有1 mL空白添加水樣并密封的樣品瓶中，然后將微量注射器活塞推壓至底部，使注射器內的有機溶劑形成一個液滴懸浮在枕頭的頂部，進行萃取。萃取結束時，將針頭的液滴抽回到微量注射器中，再拔除微量注射器并直接進行氣相色譜質譜測定。萃取時間分別為3、5、8、10、15、20、30、40 min考察不同萃取時間對萃取效果的影響。

1.3.5液液萃取

考察乙酸乙酯、正己烷和二氯甲烷三種有機溶劑提取效果，取配好的空白添加溶液，加入5 mL上述有機溶劑，分別震蕩提取5、10、15、30、45 min，靜置分層后，吸取有機相，用氮氣濃縮儀濃縮至1 mL進行氣質聯用儀分析，每個樣品平行做三次。

1.3.6固相萃取

采用固相萃取技術對水樣品進行預處理，采用的固相萃取小柱是Agilent Bond Elut Plexa C18(3 mL，200 mg)。取C18固相萃取小柱，分別加入10 mL色譜純甲醇，自然緩慢通過萃取小柱，進行小柱的活化、去除雜質。

對固相萃取柱活化后，加入10 mL空白添加水樣，上樣結束后用平穩氣流通過萃取柱15 min，使萃取柱充分干燥。用甲醇作為洗脫溶劑，洗脫體積為5 mL，用氮吹儀濃縮至1 mL進行氣質聯用分析。

2 結果與討論

2.1 標準曲線與線性范圍

在選定的儀器條件下，7種物質達到很好的分離，其選擇離子色譜圖如圖1所示，根據色譜圖可知各物質出峰時間，7種物質具體信息如表1所示。

圖1 七種鄰苯二甲酸酯總離子流圖

表2中列出了7種物質的線性方程以及線性范圍，可以看出，對于DMP,DEP,DIBP和DBP四種物質來說，有較寬的線性范圍，而BBP,DEHP和DNOP來說線性范圍相對較窄。

表2 七種鄰苯二甲酸酯類物質的線性方程

2.2 液相微萃取

實驗考察了正己烷、乙酸乙酯和二氯甲烷三種有機溶劑進行萃取，結果表明，乙酸乙酯雖然萃取率高，但是在水中形成的有機液滴非常容易從針尖脫落，而正己烷和二氯甲烷相對來說要容易的多，考慮到二氯甲烷萃取率相對較低，實驗選擇正己烷作為液相微萃取的萃取劑。以萃取時間和對各物質峰面積作圖，如圖2，可以看出20 min的萃取時間是最佳萃取時間。

圖2 不同萃取時間的影響

2.3 液液萃取

考察正己烷、乙酸乙酯和二氯甲烷三種溶劑萃取效果得知，對于DMP、DEP、DIBP、DBP、DEHP五種物質，15 min左右達到萃取平衡。對于BBP、DNOP兩種物質，30 min左右達到萃取平衡。計算萃取效率，結果見圖3， 由圖3可知，三種溶劑萃取效率均在85%以上，乙酸乙酯和正己烷比二氯甲烷高。考慮到實驗的一致性，方法選用和液相微萃取一樣的溶劑正己烷。

圖3 不同萃取溶劑萃取效率比較

2.4 固相萃取

考察不同上樣和洗脫流速對于萃取效果的影響，上樣流速分別為5，10，20，30 mL/min；洗脫速率分別為5，10，20 mL/min，做正交實驗。結果表明上樣速率為10 mL/min，洗脫速率5 mL/min時萃取效果最佳。

2.5 三種提取方法的比較

三種提取方法提取效率如圖4所示，單就萃取效率來看，固相萃取是三種方法中最低的；綜合來說，三種不同的前處理方法各有特點，都是操作性比較強的前處理方式，液液提取操作簡單，萃取效率最高，最容易被采用，但是使用溶劑量比較大，而且在萃取過程中，容易發生乳化現象，影響萃取效果，干擾也較大。液液微萃取操作簡便，所用溶劑量小，成本最低，但是對人員操作技巧較高，需要反復練習才能達到比較好的效果。而固相萃取相比于液液萃取和液相微萃取來說，成本稍高，需要專門的萃取裝置才能進行，萃取率比以上兩種萃取方法稍低，但是固相萃取能有效地減少雜質的干擾。

圖4 三種前處理方法萃取效率比較

3 結 語

本方法結合實驗教學，從前處理方法，儀器條件摸索到后續的分析，通過對氣相色譜、質譜以及氣相色譜質譜聯用技術進行深入的訓練，使學生系統的理解和掌握了這門分析測試技術，很好地體現了理論和實際相結合的教學方法。

所采用的三種前處理方式都是屬于比較容易操作的，沒有涉及很復雜的設備或者操作，成本較低，在教學允許范圍內，時間安排上也比較合理，綜合來看可行性非常高。

從設計思路上來說，計劃開發出適合教學的一系列實驗方法，繼本實驗之后，會開發出檢測實際樣品的實驗方法，便于學生全面深入掌握此項技能。需要注意的是，用鄰苯二甲酸酯類的物質作為檢測對象時，一定要避免使用塑料制品，避免污染。

本實驗所建立的方法對于實際的樣品檢測也具有非常實用的價值。還可作為本科生教學實驗和公共儀器平臺中對科研用戶進行儀器操作培訓的方法。

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