肺與大腸LPS信號通路相關性的實驗研究

劉 絮 劉曉燕 郭霞珍

（北京中醫藥大學，北京，100029）

肺與大腸LPS信號通路相關性的實驗研究

劉 絮 劉曉燕 郭霞珍

（北京中醫藥大學，北京，100029）

目的：研究肺與大腸LPS信號通路變化的相關性。方法：將實驗大鼠隨機分為生理組、高氧組、低氧組、限食組和限水組，通過測定肺與大腸中TLR4、MD2和CD14的變化觀察肺與大腸LPS信號通路的相關性。結果：高氧組和低氧組中肺部TLR4和MD2增高時，腸部也有所增高（P＜0.05），限食組和限水組中腸部TLR4和MD2增高時，肺部亦有增高（P＜0.05）。結論：可以認為肺與大腸在LPS信號通路TLR4和MD2中有相關的協同識別。

肺與大腸；LPS；TLR4；MD2；CD14

細菌內毒素脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）是革蘭陰性菌細胞外膜的主要成分，也是免疫和炎癥反應細胞的強大激活劑，是革蘭氏陰性細菌主要的致病成分，可刺激幾乎所有的真核細胞發生形態、代謝和基因表達變化，導致宿主細胞因子失控性表達，介導嚴重感染，多臟器損傷，敗血癥休克等多種疾病的發生發展[1]。因此，LPS介導的信號轉導機制已成為一個廣泛注意的研究領域，近年來已取得實質性的進展。

本實驗主要是研究肺與大腸LPS信號通路變化的相關性，肺與大腸是否具有相同的LPS的受體識別模式：ToU樣受體4（ToU Like Receptor，TLR4）、髓樣分化蛋白-2（Myeloid Differential Protein-2，MD2）和CD14協同識別。

1 材料與方法

1.1 材料 材料健康雌性SD大鼠，體重180～200 g，共50只，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。代謝籠式可變氧飼養箱，自主設計，由凌云博際（北京）科技有限公司代為加工生產。測氧儀：數字式測氧儀，北京精微恒氧技術開發中心。天平：DT系列電子天平，北京天平物華醫療儀器有限責任公司。實驗用氣體：40 L瓶裝氧氣與氣氣，北京朝紅平氣體有限公司提供。TLR4、MD2和CD14試劑盒由北京瑞格博科技發展有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 生理組大鼠模型 生理組大鼠不做任何處理，正常于代謝籠中喂養。7日后取材。

1.2.2 高氧組大鼠模型 隨機選取9只雌性SD大鼠放置于可變氧詞養箱中喂養，以10 L/min輸入氧氣，當氧氣濃度達到40%后，持續輸入氮氣1～2 L/min使氧濃度維持在（40%±3）%，用數字式測氧儀監測箱內氧濃度。每天給予8 h高氧刺激。溫度保持在25℃，濕度40%～60%，大鼠自由攝取食物和水。7日后取材。

1.2.3 低氧組大鼠模型 隨機選取9只雌性SD大鼠置于可變氧飼養箱中，以10 L/min輸入氧氣，當氧濃度達到10%后，持續輸入氮氣1～2 L/min，使氧濃度維持在（10%±1%），用測氧儀監測箱內氧濃度。每天給予8 h低氧刺激。溫度保持在25℃，濕度40%～60%，大鼠自由攝取食物和水。7日后取材。

1.2.4 限食組大鼠模型 隨機選取9只雌性SD大鼠置于代謝籠中單籠飼養，連續7天測量正常的進食量和進水量，之后按日平均進食量的50%給予喂養，飲水量不變。溫度保持在25℃，濕度40%～60%。7 d后取材。

1.2.5 限水組大鼠模型 隨機選取9只雌性SD大鼠置于代謝籠中單籠飼養，連續7天測量正常的進食量和進水量，之后按日平均進水量的50%給予喂養，進食量不變。溫度保持在25℃，濕度40%～60%。7 d后取材。

1.2.6 指標測定 大鼠造模7日后取材，腹主動脈取血后，迅速剪取肺、空腸、回腸、結腸組織，生理鹽水洗滌后，置于液氮罐中，后放置于-40℃冰箱保存。TLR4、MD2和CD14均用試劑盒進行檢測。

1.2.7 統計學方法 應用SPSS 17.0進行統計學處理，組間比較采用方差分析，P＜0.05有統計學意義。

2 結果

（見表1、表2、表3）。

2.1 生理現象 生理組和高氧組：大鼠在造模及取材過程中狀態良好，沒有顯著變化。低氧組：在造模過程中發現大鼠體重逐漸減輕，嗜睡，反應遲鈍。限食組：在造模過程中大鼠身體逐漸消瘦，造模三四日后易激惹。限水組：取材時發現大鼠結腸中糞便較多，便質堅硬。

2.2 CD14 肺和回腸：與生理組比較，其他各組組織上CD14差異均無統計學意義（P＞0.05）。空腸：高氧組組織上CD14較生理組增高，其他各組均下降（P＜0.05）。結腸：與生理組比較，其他各組組織上CD14均下降（P＜0.05）?？梢哉J為肺與大腸CD14各組之間無比較意義。

2.3 TLR4 回腸：與生理組比較，其他各組組織上TLR4差異均無統計學意義（P＞0.05）。結腸：限食組組織上TLR4較生理組降低（P＜0.05），其他各組與生理組比較均無統計學意義（P＞0.05）。空腸：與生理組比較，其他各組組織上TLR4均有增高（P＜0.05），按其大小排序，限水組＞高氧組＞低氧組＞限食組。肺：與生理組比較，其他各組組織上TLR4均有增高（P＜0.05），按其大小排序，限水組＞高氧組＞限食組＞低氧組。

2.4 MD2 回腸：與生理組比較，其他各組組織上MD2差異均無統計學意義（P＞0.05）?？漳c：與生理組比較，各組組織上MD2均有變化（P＜0.05），除限水組其他各組均有增高。結腸：與生理組比較，各組組織上MD2均降低（P＜0.05）。肺：與生理組比較，各組組織上MD2均有變化（P＜0.05），除高氧組和低氧組之外其他各組均有增高。

表1 各組大鼠肺、空腸、回腸、結腸組織上CD14的變化（ng/mL，數據統計均用±s表示）

表1 各組大鼠肺、空腸、回腸、結腸組織上CD14的變化（ng/mL，數據統計均用±s表示）

注：與生理組相比，*P＜0.05具有統計學意義。

組別例數肺空腸回腸結腸生理組9 38.59±2.78 3.31±0.64 15.17±5.10 26.72±4.01高氧組9 41.32±5.28 5.10±4.08*16.12±3.44 17.40±4.57*低氧組9 41.80±5.09 3.13±0.46*17.84±3.01 18.96±4.84*限食組9 41.01±3.57 3.12±0.78*13.03±6.06 21.36±5.45*限水組9 39.17±3.71 3.12±0.78*16.31±1.86 18.97±6.08*

表2 各組大鼠肺、空腸、回腸、結腸組織上TLR4的變化（ng/mL，數據統計均用±s表示）

表2 各組大鼠肺、空腸、回腸、結腸組織上TLR4的變化（ng/mL，數據統計均用±s表示）

注：與生理組相比，*P＜0.05具有統計學意義。

組別例數肺空腸回腸結腸生理組9 2.06±0.13 0.16±0.030.87±0.26 1.03±0.15高氧組9 2.23±0.24*0.27±0.20*1.02±0.23 0.84±0.19低氧組9 2.08±0.16*0.18±0.04*1.00±0.33 0.93±0.14限食組9 2.19±0.19*0.17±0.18*0.77±0.35 0.93±0.17*限水組9 2.29±0.16*0.97±0.22*1.05±0.21 0.97±0.22

表3 各組大鼠肺、空腸、回腸、結腸組織上MD2的變化（ng/mL，數據統計均用±s表示）

表3 各組大鼠肺、空腸、回腸、結腸組織上MD2的變化（ng/mL，數據統計均用±s表示）

注：與生理組相比，*P＜0.05具有統計學意義。

組別例數肺空腸回腸結腸生理組9 2.28±0.41 0.13±0.04 0.60±0.25 1.04±0.18高氧組9 2.23±0.19*0.21±0.13*0.85±0.30 0.60±0.14*低氧組9 2.20±0.33*0.15±0.03*0.77±0.29 0.67±0.15*限食組9 2.47±0.21*0.14±0.04*0.61±0.52 0.59±0.22*限水組9 2.70±0.15*0.10±0.05*0.77±0.26 0.77±0.27*

3 討論

LPS誘導的炎癥反應信號傳導通路：脂多糖結合蛋白（LPSBinding Protein，LBP）將LPS傳遞給CD14分子，由CD14介導LPS細胞內傳導而使NF-κB激活，誘導促炎細胞因子TNF、白介素、黏附分子等的表達。LPS與血清中sCD14結合，再與細胞膜上的受體結合將信號轉導到細胞內。CD14與多種傳遞信號的跨膜信號受體不同，CD14分子缺乏胞漿區段，因此CD14不能直接和細胞內進行信號交流，尚需其他分子起信號傳導作用。研究發現Toll樣受體是LPS信號向細胞內傳導的門戶蛋白。作為LPS的低親和力受體的TLR4可以轉導刺激信號。二者結合即可形成具備高親和力結合和信號轉導功能的受體復合體，將信號轉導到細胞內[2]。而MD2是協助TLR4完成LPS信號轉導通路的必不可少的因素。研究[3]發現MD2不僅能增強TLR4對LPS的反應性，還能拓寬TLR4對LPS結構的識別范圍。MD2可能幫助TLR4識別LPS/LBP/CD14復合物，并將LPS鎖定在結合位點上[4]。MD2在TLR4介導的LPS信號通路中具有重要作用。

TLR4在細胞表面與MD2及CD14協同，形成TLR4/MD2/CD14聚合體，共同識別革蘭氏陰性菌的脂多糖（LPS）、內源性配體如熱休克蛋白（Hsp60、Hsp70）等配體，將其信號傳導到細胞內，引起下游信號途徑的激活[5]。

在本實驗中，通過數據分析可以知道肺病模型中肺部TLR4和MD2增高時，腸部也有所增高，腸病模型中腸部TLR4和MD2增高時，肺部亦有增高。TLR4和MD2的表達在肺與大腸之間是呈正相關關系的，表明肺與大腸在炎癥形成及防治中存在緊密的內在聯系。可以認為肺與大腸在LPS信號通路是有相關性的，在TLR4和MD2有相關的協同識別，可以為臨床實踐提供相應的實驗數據。

[1]楊一新，李桂源.LPS所介導的信號轉導通路研究進展[J].中南大學學報：醫學版，2006，31（1）：141.

[2]胡承香，楊清武，呂鳳林，等.CD14與TLR4相互作用的實驗研究[J].第三軍醫大學學報，2004，26（10）：882.

[3]李永旺，麻莉.內毒素誘導的TLR4-MD2信號傳導通路[J].中國藥理學通報，2002，18（2）：121.

[4]鐘田雨，劉靖華，蔣勇.髓樣分化蛋白-2在識別和轉導內毒素信號中的作用[J].生物化學與生物物理進展，2007，34（5）：460-464.

[5]Cararnalhol，Lopes-CarvalhoT，OstlerD，etal.Regulatory T cells selectively express toll-like receptors and are activated by lipopolysaccharide[J]. JExp Med，2003，197（4）：403-411.

（2014-03-11收稿 責任編輯：洪志強）

The Experiment al Study on LPS Signal Path Correlation of Lung and Large Intestine

Liu Xu，Liu Xiaoyan，Guo Xiazhen
（Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

Objective：To study LPSsignal path changesof lung and large intestine.Methods：Micewere random ly divided into physiological group，hyperoxia group，hypoxia group，diet restriction group，water restriction group.The LPS signal path's correlation of lung and large intestine was observed detecting changes of variation of TLR4，MD2 and CD14 in lung and large intestine.Results：When TLR4 and MD2 in the lungs of hyperoxiagroup and hypoxia group increased，they also increased in the large intestines.When TLR4 and MD2 in the large intestines of diet restriction group and water restriction group increased，they also increased in the lungs.Conclusion：Lung and large intestine can be thought to have related synergy identification in TLR4 and MD2 of LPS signal path.

Lung and large intestine；LPS；TLR4；MD2；CD14

R221；R256.1；R332

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2014.04.007

國家重點基礎研究發展計劃（973計劃）項目（編號：2009CB522706）

劉絮（1989—），女，山東濟寧人，在讀碩士研究生，中醫基礎理論。E-mail：liuxu039＠sina.com

郭霞珍（1950—），女，浙江杭州人，教授，主任醫師，研究方向：四時五臟陰陽