胎盤Hofbauer細胞及其hAⅤ表達①

王 健 周 娜 （安徽理工大學醫學院病原學與免疫學教研室，淮南 232001）

胎盤Hofbauer細胞及其hAⅤ表達①

王 健 周 娜 （安徽理工大學醫學院病原學與免疫學教研室，淮南 232001）

胎盤是妊娠期間存在的特有器官，不僅能夠實現母體和胎兒間物質交換，還可以通過胎盤屏障抵抗各種侵入胚胎的病原微生物。Hofbauer細胞是胎盤巨噬細胞，位于絨毛間質內，能夠捕獲和提呈抗原信息，參與母胎免疫反應;其表面表達人膜聯蛋白Ⅴ（Human AnnexinⅤ，hAⅤ）等多種受體。hAⅤ是鈣離子依賴的磷脂結合蛋白家族成員，參與細胞內、外多種代謝過程，如細胞信號轉導、分化、細胞膜運輸、胞吞、胞吐作用等。本文圍繞胎盤Hofbauer細胞及其hAⅤ研究進展進行綜述，現將結果報道如下。

1 胎盤發育和Hofbauer細胞的形成

1.1 胎盤組織發育 胎盤是孕婦分娩時脫離子宮的附屬結構，呈圓盤狀，中央較厚，邊緣較薄，厚2.0 ～2.5 cm，直徑平均約 22 cm，重約 470 g［1］。向著羊膜光滑的一面為子面，可見絨毛組織;另一面較粗糙的為母面（如圖1），是胎盤剝離時撕裂斷的蛻膜組織，可見黑褐色的小葉或子葉。胎盤是由羊膜、葉狀絨毛膜（亦稱叢密絨毛膜）和底蛻膜構成。

在妊娠期間，胎盤的細胞成分較復雜，既有滋養層細胞，又有間質細胞、單核巨噬細胞等，通常不含漿細胞，胎盤上皮細胞（滋養層細胞）在多處與免疫細胞直接接觸。在胎盤子面，滋養層干細胞在絨毛間質內與Hofbauer細胞相鄰;在胎盤母面，入侵的滋養層細胞與母體子宮內NK細胞（CD56 bright）、巨噬細胞和T細胞聚集。胎兒細胞滋養層能夠使母體免疫細胞遷移［2］。人類胎盤細胞主要指合體滋養層細胞（Syncytiotrophoblast，SCT）［3］，該細胞位于與母親血液直接接觸的滋養層陷窩內;基質細胞下是胎兒的毛細血管，主要由成纖維細胞（Fibroblasts，FIBs）和Hofbauer細胞或者胎兒組織的巨噬細胞組成。Bui等［4］在探討齊多夫定（Zidovudine，ZDV）對受HIV感染的胎盤滋養層細胞和Hofbauer細胞影響時，發現滋養層細胞和Hofbauer細胞是胎盤兩個主要細胞類型，盡管滋養層細胞僅占胎盤體重的13%，但它是新陳代謝最活躍的細胞。絨毛膜滋養層細胞開始分化成兩種類型，合體滋養層細胞、單核滋養層細胞。滋養層細胞融合形成多核滋養層細胞圍繞在胎兒毛細血管周圍的內皮細胞，單核滋養層細胞排列在靠近母親外周血的血竇。Hofbauer細胞是胎盤巨噬細胞［5］，分泌血管生成因子（VEGF），參與胎盤早期血管生成;表達多種細胞因子，參與胎盤的免疫反應。

1.2 胎盤Hofbauer細胞結構 150多年前，有學者從人胎盤絨毛中發現Hofbauer細胞，亦稱胎盤組織巨噬細胞，其形態為圓形或橢圓形，大小約10～30 μm，單核、偏位，光學顯微鏡下可見Hofbauer細胞分布在胎盤間質內，個體較大，形狀不規則，胞核呈卵圓形，胞漿較多;胞質內含大小不一的空泡和致密顆粒。電子顯微鏡下見Hofbauer細胞表面有液泡、大的偽狀板足、褶壁［6］。Hofbauer細胞在孕早期來源于間質細胞［7］，在孕后期源于胎兒骨髓的單核細胞。受精后18 d，Hofbauer細胞開始出現在絨毛小葉中。妊娠5～6個月數量開始減少，足月時，絨毛小葉間質內的Hofbauer細胞已非常少見。有人認為足月時Hofbauer細胞并未減少，只是由于足月時絨毛小葉間質的密度增加，難以觀察到Hofbauer細胞。

1.3 胎盤Hofbauer細胞功能 Hofbauer細胞數量與血管生成有關。在孕早期和中期，多數絨毛不成熟時，Hofbauer細胞存在與基質相連的滋養層和毛細血管中，與胎兒血管生成有關。Hofbauer細胞位于滋養層細胞和胎兒毛細血管［8］，使它們在絨毛膜結締組織核心更好地參與和調節胎盤生長過程。采用Ficoll和Percoll梯度離心法將Hofbauer細胞從胎盤中分離出來，殘留的滋養層細胞使用抗表皮生長因子受體包被免疫磁珠微球黏附法去除。分離出來的細胞鑒別采用抗-CD68免疫組化法染色，其中90%以上的細胞呈陽性，結果顯示每20 g的胎盤組織含有Hofbauer細胞達106。

Hofbauer細胞起源于胎盤絨毛膜間質細胞，能夠吞噬凋亡和破損的細胞，在炎癥和病原微生物入侵時產生抗體，發揮免疫保護作用。其沿著基質通道自由移動，參與基質水分調節、離子的運輸和組織液的流動，加強宿主免疫防御作用。Kim等［9］選擇妊娠22～42周含有VUE（Villitis of unknown etiology）的胎盤，其產婦無明顯臨床癥狀，采用原位雜交和免疫組化法檢測，結果顯示不明病原體絨毛間質區域中發現少量含CD68、CD14雜交信號的Hofbauer細胞，并伴有 CD4+、CD8+細胞浸潤，提示 Hofbauer細胞對防御不明病原體侵入、降低胎盤的炎癥病變有重要作用。

2 hAⅤ的結構和功能

2.1 hAⅤ的結構 人膜聯蛋白Ⅴ又稱ANXA5，是鈣離子依賴的磷脂結合蛋白家族成員，廣泛分布于各種組織細胞中，具有多種生理功能。Annexin A5由 ANXA5 基因編碼［10，11］，位于染色體 4q26-q28，其表面具有親水基團的水溶性蛋白，由320個氨基酸相互折疊而成四個同源結構域，分子量34 kD，核心蛋白的羧基末端包含四個重復序列，每個羧基端約含有70個氨基酸，（如圖2示），該高度保守序列是介導鈣離子與磷脂結合、細胞膜脂質雙層鈣離子通道形成的分子基礎，啟動子不能識別 TATA區域［12］。迄今為止至少發現12種家族成員，編碼序號分別為Ⅰ～Ⅻ，是人類基因圖譜NIH/CEPH的一部分。ANXA5含有12個內含子，長約38.5 kb;13個外顯子，長約28 kb，編碼獨特的N末端和核心中高度保守的C端區域。細胞外的膜聯蛋白在腎臟、肝臟等器官中豐富表達，但在胎盤中表達水平最高，最初曾被稱為“胎盤抗凝蛋白”。1990年 Huber等［13］發現了膜聯蛋白晶體結構—Human AnnexinⅤ。含有四個折疊的同源結構域，這四個結構域根據氨基酸序列如下區分:氨基末端:17-88;結構Ⅰ:17-88;結構Ⅱ:89-159;連接區域:160-167;結構Ⅲ168-246;結構Ⅳ:247-317。膜聯蛋白家族都具有相同的表面結構和高度相似的α螺旋緊密折疊區域及高度重復序列［14］。A-E五個α螺旋組成一個結構域，A、B、D、E四個平行螺旋位點的軸線與C螺旋近似垂直相連，分子總體是含一個凹面和凸面的平緩曲線。四個結構域平行排列為一組，多肽鏈的N端和C端相互連接使A～D區域非共價結合。結構域Ⅱ和Ⅲ、Ⅰ和Ⅳ的疏水基團緊密連接在一起產生的兩個分子雙面對稱。在分子的中心親水基團突起形成一個離子通道，這個通道由ⅡA、ⅡB、ⅣA、ⅣB四個螺旋組成，帶有具有高度穩定的極性或帶電物質。通過電子密度可以清楚地認識到結構中嵌入的水分子主要位于中心的離子通道中。鈣離子結合位點位于膜聯蛋白的凸面，凸面含有磷脂和鈣離子結合部位，膜結合位點位于折疊內聯蛋白內第17個氨基酸序列處。Annexin A5［15］缺乏分泌到外部的5’區域序列，35.7 kD，Huber通過X射線發現Annexin A5可溶性三級結構，其三級結構的核心由四個區域循環排列，這樣的排列使分子表面為凹面和凸面稍彎曲形狀。凸面與是鈣離子結合位點，凹面連接一段短的氨基末端。Annexin A5內部通過非共價相互作用。Annexin A5單體與磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）結合首先形成三聚體其次形成2D晶體模式。在形成的三聚體中Annexin A5的結構域Ⅱ位于內部。Ⅲ、Ⅳ位于外部。2D晶體模式由三聚體、二聚體和三聚體、三聚體和三聚體形成分別對稱的低密度P6和高密度P3兩種結構。這兩種晶體模式的形成取決于細胞膜PS的含量和鈣離子密度。從三維結構［16］分析（如圖3），膜聯蛋白Ⅴ鈣離子結合位點可以分為兩類，AB和DE循環。AB位點是鈣離子和磷脂結合位點及與磷脂酶A2的結合部位。

圖1 胎盤的形態結構Fig.1 M orphological structure of placenta

圖2 人膜聯蛋白Ⅴ蛋白質結構Fig.2 Protein structure of Hum an Annexin V

圖3 膜聯蛋白Ⅴ的分子結構［16］Fig.3 M olecular structure of Annexin V［16］

2.2 hAⅤ的功能 人Annexin V作為一種細胞內蛋白，缺乏一個疏水信號肽，常存在于培養的內皮細胞、羊水、血小板血漿和活化的血小板中，亦可存在于人滋養層細胞和胎盤絨毛細胞。有學者從肥厚的軟骨細胞中發現Annexin V，免疫熒光檢測發現其位于微絨毛表面，免疫電鏡顯示細胞表面碘化。為確定Annexin V是否是從細胞內分泌和釋放的，Wang等［17］構建一種轉基因cos-7細胞，作用于內質網高爾基體，經典分泌途徑作用于氨基酸末端的一個信號肽，通過轉染的COS-7細胞確定Annexin V是否分泌信號肽。疏水信號肽序列的缺乏使Annexin V不能通過內質網和高爾基體的加工和處理。當內皮細胞或滋養層細胞受損，胞內Annexin V釋放，釋放的Annexin V與相鄰細胞表面暴露的PS結合，通過帶負電荷的磷脂阻止凝血因子的激活。

人annexin V屬膜聯蛋白家族成員，廣泛分布于多種組織，與磷脂酰絲氨酸有很高的親合力，以Ca2+依賴方式與帶負電荷的磷脂結合，并向細胞核或細胞膜移位，參與細胞內、外多種代謝過程，如促有絲分裂信號轉導、分化、細胞膜運輸、胞吞、胞吐作用等。Annexin V的親水核心就是離子通道，鈣離子結合位點位于Annexin V凸面膜上。細胞內豐富的PS和Annexin-A5與細胞外高濃度的鈣離子結合到一起［18］。PS和Annexin-A5結合組裝成2D晶體結構暴露在破損細胞膜邊緣，觸動鈣離子聚集。體外研究表明Annexin-A5 2D結構能夠固定于單層脂質，減少磷脂層的橫向擴散，推測Annexin-A5 2D結構通過抵消由于細胞骨架附著形成的膜張力，促進受損細胞膜的修復，阻止細胞膜進一步破裂。通常情況下，磷脂酰絲氨酸位于細胞膜內部［15］，但在活化血小板、死細胞及一些白細胞中磷脂酰絲氨酸從膜內外翻。膜聯蛋白Ⅴ依賴鈣離子和外翻的磷脂酰絲氨酸結合形成2D晶體模式。在20世紀70年代末，人們首次從胎盤內分離出hAⅤ，幾年后這種蛋白在血管中發現，因為其具有抗凝血功能而被命名為抗凝血蛋白?？鼓龣C制使hAⅤ與血漿具有較高的親和力，這個特性使AnxA5能夠很好地阻斷凝血酶原復合物的活性［x-±s，50%抑制濃度，（16±12）nmol/L］。研究表明［19］膜聯蛋白的功能多樣，既可以作為一些酶類如酪氨酸酶的底物，又參與胞外分泌，AnnexinⅠ分泌前列腺素參與精子生成及抗凝等作用。另外Annexin V還參與細胞識別和黏附的功能。AnnexinⅤ因在細胞凋亡中的廣泛應用而在膜聯蛋白中扮演特殊的角色。在細胞凋亡早期的特點是磷脂酰絲氨酸從胞內轉移到胞外（外翻），AnnexinⅤ在鈣離子介導下與PS磷脂酰絲氨酸結合，選擇合適的標記物（熒光、酶、膠體金），可以用于檢測細胞凋亡，提示Annexin V對細胞凋亡有促進作用。Annexin V還可用于血小板活化和促凝血機制的研究。胎盤抗凝蛋白 hAⅤ在人體滋養層（SCTs）高表達［20］，hAⅤ在細胞脂質層形成2D晶體結構輔助凝血酶抗凝作用。hAⅤ位于胎盤SCTs的頂層，在絨毛血液循環中發揮重要的抗凝作用（如圖4）。在懷孕的小鼠體內注入抗hAⅤ抗體，發現隨著孕期的發展和胎兒的生長，胎盤出現壞死和纖維化。已經證實抗磷脂抗體（antiphospholipid，aPL）能夠介導hAⅤ表達的減少。調查羥化氯喹（Hydroxychloroquine，HCQ）可以直接影響aPL-h AⅤ血栓形成機制，通過橢圓偏振技術和原子力顯像技術顯示aPL免疫復合物位于細胞膜磷脂雙分子層，羥化氯喹（HCQ）直接阻斷aPL免疫復合物的形成和促進h AⅤ的修復。Di Simone等［21］探討 aANX（anti-annexin V）單克隆抗體與滋養層細胞結合對于人絨毛膜促性腺激素（Human chorionic gonadotrophin，HCG）分泌和細胞凋亡的影響，通過實驗發現人滋養層分化過程中的磷脂酰絲氨酸分泌增加，負電荷磷脂酰絲氨酸的暴露為hAⅤ提供結合位點，hAⅤ-磷脂酰絲氨酸復合物增加到一定水平后與aANX抗體結合。aANX識別hAⅤ后，hAⅤ與磷脂的結合減少，從而抑制其抗凝作用。aPL抗體使AnxA5晶體結構中暴露的磷脂產生間隙［22］，并且能夠促進血液凝固。在人工磷脂膜和內皮細胞、滋養層細胞等細胞膜中已經證實aPL能夠破壞AnxA5的晶體結構。羥化氯喹可以通過以下兩種途徑阻止aPL的作用:①阻止aPL-IgG糖蛋白復合物的形成;②促進AnxA5晶體破壞區域的修復。

圖4 膜聯蛋白Ⅴ與磷脂酰絲氨酸結合及其抗凝功能Fig.4 Annexin V binding to phosphatidylserine plays a role of anticoagulation

3 Hofbauer細胞與HBV宮內感染

體外實驗證實［23］HBV能夠直接吸附于Hofbauer細胞表面，并侵入Hofbauer細胞內進行復制表達，釋放出有感染性的病毒顆粒，培養上清液中可檢出HBsAg，提示Hofbauer細胞在介導HBV宮內感染中發揮重要作用。HBV-DNA［24］在胎盤母面到胎兒面濃度的減少說明HBV宮內感染的一種可能機制是病毒在胎盤細胞間的轉移。胎盤細胞組成一層緊密相連的單層上皮細胞，頂端與母親血液相接，基底層與胎兒血液循環相連。在孕20周，這些細胞末端經過分化和融合形成合體滋養層細胞，合體滋養層細胞組成胎盤屏障進行母胎物質運輸。在孕早期HBV通過胞吞作用穿過胎盤屏障感染胎兒。HBV能夠通過囊泡運輸跨過滋養層細胞保持傳染性。Annexin V是一種細胞內蛋白，常存在于培養的內皮細胞、羊水、血小板血漿和活化的血小板中，亦可存在于人滋養層細胞和胎盤絨毛細胞。Hofbauer細胞是胎盤巨噬細胞，其表面表達Annexin V受體。白桂芹等［25］通過SP法檢測30例HBsAg陽性孕婦足月分娩胎盤和20例正常足月胎盤表面hAⅤ的分布和表達，探討其在乙肝宮內感染中的意義。結果發現實驗組和對照組的絨毛滋養層細胞、絨毛間質細胞、毛細血管內皮細胞均可見hAⅤ表達;HBV感染的標本中hAⅤ從母面絨毛滋養層細胞、絨毛間質細胞至胎兒面絨毛毛細血管內皮細胞逐層遞減。HBV感染的胎盤組織hAⅤ表達上調，hAⅤ可能作為受體介導了HBV感染胎盤細胞，引發宮內感染。De Meyer等［26］研究表明hAⅤ作為一種鈣離子依賴的磷脂結合蛋白，主要表達于人類的肝細胞，不感染鼠類的肝細胞或肝細胞膜，其可與HBsAg特異性結合。鼠源Annexin V和人源Annexin V的氨基酸序列有90%的同源性，但鼠源Annexin V不能有效的結合HBsAg。將含hAⅤ的結構基因轉染大鼠肝癌細胞系，可致其表達hAⅤ，并增強對HBV的易感性。當hAⅤ轉染原代大鼠肝細胞后，可分別檢出HBV的 mRNA、HBV（cccDNA）、復制中間體、HB-sAg、HBcAg和HBV-DNA，而未轉染hAⅤ者，未檢出病毒復制標志物。Hofbauer細胞表面表達Annexin V受體可能是介導HBV宮內感染的關鍵受體。

綜上所述，Hofbauer細胞作為胎盤的巨噬細胞，通過吞噬凋亡和破損的細胞，在抗炎和抵御病原微生物入侵時發揮保護作用。hAⅤ作為Hofbauer細胞表面的關鍵受體，以Ca2+依賴方式與帶負電荷的磷脂酰絲氨酸結合。hAⅤ亦可作為HBV受體，與病毒表面的S蛋白特異性結合，使病毒通過跨膜轉運進入細胞內，介導HBV宮內感染。

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［收稿2013-05-08 修回2013-06-09］

（編輯 倪 鵬）

R392 R715.2

A

1000-484X（2014）05-0708-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2014.05.032

①本文為安徽省教育廳自然科學基金項目（No.KJ2008A153）和安徽省自然科學基金項目（No.1308085MH148）。

王 ?。?962年-），男，教授，碩士生導師，主要從事病毒感染與免疫方面研究，E-mail:wangjian8237@sina.com。