登革病毒感染及其實驗室檢查

林迪，孫長貴

(解放軍第117醫院檢驗科南京軍區醫學檢驗質控中心，浙江杭州310013)

·述評·

登革病毒感染及其實驗室檢查

林迪，孫長貴

(解放軍第117醫院檢驗科南京軍區醫學檢驗質控中心，浙江杭州310013)

登革熱是登革病毒引起的一種急性傳染病，是世界上蔓延速度最快的蟲媒病毒感染疾病，WHO根據臨床表現把登革熱分為典型登革熱(Dengue fever，DF)、登革出血熱(Dengue haemorrhagic fever，DHF)和登革休克綜合征(Dengue shock syndrome，DSS)三型。登革熱廣泛流行于全球熱帶及亞熱帶地區，嚴重威脅全球25億人口的健康，每年有超過5000萬人感染登革熱。今年6月份以來，我國廣東省登革熱疫情呈暴發式增長，截至2014年10月10日零時，廣東省衛計委最新通報顯示全省共有20個地級市報告登革熱臨床診斷和實驗室確診病例27593例，較去年同期上升2610.51%，引起國人廣泛關注。本文就該病毒的結構、生物學特性、流行病學、臨床表現、診斷與鑒別診斷和實驗室檢查等作簡要綜述。

登革熱病毒；蟲媒；流行病學；感染；實驗室檢查

DOI∶10.3969/j.issn.1674-1129.2014.06.001

登革熱是由登革病毒引起的急性傳染病，該病毒主要通過埃及伊蚊或白紋伊蚊叮咬傳播，除了人類埃及斑蚊外，登革病毒的自然宿主尚有低等靈長類(黑猩猩、長臂猿、彌猴)，1931年Simmons等學者首先證實登革病毒可經由猴子傳播猴子或經由猴子傳播給人，但相對很少有能證明在人類之間傳播的相關病毒動力學和模式研究[1-3]。登革病毒感染所致疾病包括從較輕的登革熱(DF)到嚴重致死性的登革出血熱(DHF)以及登革休克綜合癥(DSS)。WHO估計每年全球有5000萬例登革熱和幾十萬例登革出血熱[4]。本文就登革病毒相關的結構和生物學特性、發病機制、流行病學、臨床表現、診斷與鑒別診斷和實驗室檢查等作簡要綜述。

1 登革病毒的結構和生物學特性

登革病毒屬B組蟲媒病毒，黃病毒科黃病毒屬。病毒顆粒呈啞鈴狀(700nm×20～40nm)、棒狀或球形(直徑45～55nm)，為單股正鏈RNA病毒，RNA分子量4.103kD。登革病毒核心為RNA與蛋白質組成的20面立體對稱的病毒顆粒，外層為兩種糖蛋白組成的包膜，包膜含有型和群特異性抗原，用中和試驗可鑒定其型別。病毒基因編碼3個結構蛋白和7個非結構蛋白，3個結構蛋白為：E蛋白(包膜蛋白)、C蛋白(核心殼蛋白)和M蛋白(膜蛋白)，E蛋白含有中和抗原和病毒的種、屬、型等特異性表位，可誘導機體產生中和抗體、血凝抑制抗體，此外還可能引起抗體依賴的增強感染作用(ADE)，C蛋白可能在蛋白質和RNA的相互作用中發揮作用，M蛋白與病毒感染能力的強弱有關；7個非結構蛋白為：NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5[5]。登革病毒按照血清學方法可分為4種血清型：DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4，4種血清型均可感染人。登革病毒對熱敏感，56℃30min可滅活，但在4℃條件下其感染性可保持數周之久。超聲波、紫外線、0.05%甲醛溶液、乳酸、高錳酸鉀、龍膽紫等均可滅活病毒。病毒在pH 7～9時最為穩定，在-70℃或冷凍干燥狀態下可長期存活[6]。

2 發病機制

登革病毒感染的發病機理迄今尚未完全闡明，目前關于登革病毒感染的假說主要有以下幾種。

2.1 病毒細胞和組織嗜性

2.1.1 細胞的免疫系統蚊蟲叮咬人類后，登革病毒通過表皮和真皮進入血液，感染未成熟的朗格漢斯細胞[表皮樹突狀細胞(DC)]和角化細胞[7，8]，感染細胞然后遷移至淋巴結，單核和巨噬細胞聚集的淋巴結成為感染的靶目標，隨后感染擴散并通過淋巴系統傳播[9]。

2.1.2 器官損傷Martina BE等人通過相關文獻統計了160例登革熱感染的致命病例，并對其尸檢結果進行回顧性分析發現，登革病毒存在于皮膚、肝臟、脾臟、淋巴結、腎臟、骨髓、肺臟、胸腺和大腦[9]，廣州市第八人民醫院張復春等研究發現，大部分登革熱患者同時合并有肝損害，患者中超過2/3有肝功能異常，10.7%及11.8%患者ALT與AST水平升高5倍以上[10]。

2.1.3 內皮細胞(EC)EC是否為登革病毒的嗜性細胞還存在爭議，但是一些研究顯示，血管損傷或功能障礙是DHF/DSS的主要發病機制，DHF/ DSS最主要的臨床表現是廣泛的毛細血管通透性增加而引起的大量血漿滲漏和出血[11]。

2.2 病毒毒力有研究人員認為DHF/DSS的發生是受一種毒力更強的登革病毒株的感染。登革病毒作為一個正鏈RNA病毒，缺乏精確的復制校正系統，在傳播過程中核苷酸的變化會導致病毒毒力的變化，從而產生毒力更強的病毒株[12]。

2.3 補體系統的激活登革病毒NS l蛋白可以表達在感染細胞的表面，是登革病毒感染體液免疫主要靶分子[13]。NSl可誘導抗NS1抗體產生，這種抗NS1抗體可通過分子模擬機制與病毒感染宿主的血管內皮細胞和血小板非特異性結合，有效激活補體系統，生成大量毒性補體成分和攻膜復合體，直接和(或)間接作用于血管內皮細胞[14]。

2.4 宿主的遺傳因素[9]與DHF/DSS相關的非HLA和HLA遺傳因素有：TNF-α、維生素D受體、FcrIIa受體、CTLA-4、TGF-β、甘露糖凝集素2 (MBL2)、抗原提呈相關轉運蛋白和人類血小板抗原基因的多態性；葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PD)缺乏；HLAⅠ類等位基因A*01、A*0207、A*24、B*07、B*46、B*5；HLAⅡ類等位基因DQ*1、DR*1、DR*4。

2.5 抗體依賴性感染增強(ADE)血清學研究證實，登革病毒表面存在群特異性決定簇和型特異性決定簇，群特異性決定簇產生的抗體對登革病毒感染有較強的增強作用，稱增強性抗體；型特異性決定簇產生的抗體具有較強的中和作用，稱中和抗體，能中和同一型登革病毒的再感染，對異型病毒也有一定中和能力。當機體二次感染不同型登革病毒時，如血清中增強性抗體活性弱，而中和抗體活性強，足以中和入侵病毒，則病毒血癥迅速被消除，患者可不發病；反之，體內增強性抗體活性強，后者與病毒結合為免疫復合物，通過單核細胞或巨噬細胞膜上的Fc受體，促進病毒在這些細胞中復制，出現ADE效應，導致患者臨床癥狀加重。

2.6 交叉反應性T細胞反應雖然記憶T細胞交叉反應可以提供一定的保護性免疫，但同時它們也可引起顯著的免疫病理學反應[15]。CD8+細胞毒性T淋巴細胞(CTL)具有血清型交叉反應性，能溶解被所有4種血清型病毒抗原刺激或感染的細胞，可能參與病毒再次感染期間的免疫病理損傷。

2.7 細胞因子及可溶性因子風暴高病毒載量和大量非保護T細胞的激活會引起炎性細胞因子、可溶性因子及其他介質“風暴”，這些物質的過量釋放可激活補體系統與凝血系統，使血管通透性增加，從而導致以血漿滲漏為主要特征的DHF/ DSS[16]。多項研究也證明了這個觀點，研究人員發現嚴重登革熱感染期患者血漿中IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-13、IL-18、TGF-1β、TNF-α及IFN-γ的含量顯著提高，尤其是DSS[17-20]。其它介質和可溶性因子包括血管內皮生長因子(VEGF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)、巨噬細胞移動抑制因子、促血小板生成素、可溶性血管細胞黏附分子1 (VCAM-1)、可溶性ICAM-1、血管性血友病因子抗原、血栓調節蛋白、E-選擇素、組織因子(TF)、纖溶酶原激活物抑制劑1(PAI-1)和組織纖溶酶原激活物[21-26]。

3 流行病學

登革熱流行于全球熱帶及亞熱帶地區，尤其是在東南亞、太平洋島嶼和加勒比海等100多個國家和地區，已成為熱帶及亞熱帶地區非常嚴重的公共衛生問題[27]。在我國，1978年廣東佛山首先爆發流行，以后在海南、廣東、廣西、福建、臺灣、香港及澳門等地均有小規模流行。近年來，全球登革病毒流行存在血清學漂移。我國登革病毒四種血清型均曾流行過，1995年以來，登革病毒1型是廣東登革熱流行的主要優勢株，但是近年發生了登革病毒2、3、4型感染本土病例流行[28]。登革熱主要發生在夏秋季，居家待業和離退休人員較多。2014年6月以來廣東爆發的登革熱疫情據廣東省衛計委最新通報顯示，截至2014年10月10日零時，全省共有20個地級市累計報告登革熱病例27593例，較去年同期(1018例)上升2610.51%。病例分布為：廣州(23484例)、佛山(2337例)、中山(392例)、江門(333例)、珠海(235例)、東莞(143例)、肇慶(125例)、深圳(122例)、陽江(104例)、湛江(97例)、清遠(67例)、汕頭(51例)、茂名(27例)、揭陽(27例)、潮州(18例)、河源(11例)、惠州(8例)、云浮(5例)、汕尾(4例)、韶關(3例)。累計報告死亡病例6例，其中廣州5例，佛山1例。

3.1 傳染源登革熱患者、隱性感染者和登革病毒感染的非人靈長類動物以及帶毒的媒介伊蚊。

3.2 傳播途徑主要通過伊蚊叮咬傳播。傳播媒介主要為埃及伊蚊和白紋伊蚊。

3.3 高危人群二次感染患者；伴有糖尿病、高血壓、冠心病、肝硬化、消化性潰瘍、哮喘、慢阻肺、慢性腎功能不全等基礎疾病者；老人或嬰幼兒；肥胖或嚴重營養不良者；孕婦。

4 臨床表現和病理特點[6,29]

登革熱的潛伏期一般為3～15d，多數5～8d。登革病毒感染可表現為無癥狀隱性感染、非重癥感染及重癥感染等。典型的登革熱病程分為三期，即急性發熱期、極期和恢復期。根據臨床表現嚴重程度，分為登革熱(DF)、登革出血熱(DHF)、登革休克綜合征(DSS)三個臨床型。

4.1 急性發熱期患者通常急性起病，首發癥狀為發熱，可伴畏寒，24h內體溫可達40℃。部分病例發熱3～5d后體溫降至正常，1～3d后再度上升，稱為雙峰熱型。發熱時可伴頭痛，全身肌肉、骨骼和關節疼痛，明顯乏力，并可出現惡心，嘔吐，腹痛，腹瀉等胃腸道癥狀。急性發熱期一般持續2～7d。于病程第3～6d在顏面四肢出現充血性皮疹或點狀出血疹。典型皮疹為見于四肢的針尖樣出血點及“皮島”樣表現等。可出現不同程度的出血現象，如皮下出血、注射部位瘀點瘀斑、牙齦出血、鼻衄及束臂試驗陽性等。

4.2 極期部分患者高熱持續不緩解，或退熱后病情加重，可因毛細血管通透性增加導致明顯的血漿滲漏，嚴重者可發生休克及其他重要臟器損傷等。極期通常出現在疾病的第3～8d。出現腹部劇痛、持續嘔吐等重癥預警指征往往提示極期的開始。在血漿滲漏發生前，患者常常表現為進行性白細胞減少以及血小板計數迅速降低。不同患者血漿滲漏的程度差別很大，如球結膜水腫、心包積液、胸腔積液和腹水等。紅細胞比容(HCT)升高的幅度常常反映血漿滲漏的嚴重程度。如果血漿滲漏造成血漿容量嚴重缺乏，患者可發生休克。長時間休克患者可發生代謝性酸中毒、多器官功能障礙和彌散性血管內凝血。少數患者沒有明顯的血漿滲漏表現，但仍可出現嚴重出血如皮下血腫、消化道大出血、陰道大出血、顱內出血、咯血、肉眼血尿等；患者還可出現腦炎或腦病表現(如劇烈頭痛、嗜睡、煩躁、譫妄、抽搐、昏迷、頸強直等)，急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，急性心肌炎，急性肝衰竭，急性腎功能衰竭等。

4.3 恢復期極期后的2～3d，患者病情好轉，胃腸道癥狀減輕，進入恢復期。部分患者可見針尖樣出血點，下肢多見，可有皮膚瘙癢。白細胞計數開始上升，血小板計數逐漸恢復。

5 診斷與鑒別診斷[6,29]

5.1 登革熱診斷根據流行病學史、臨床表現及實驗室檢查結果，可做出登革熱的診斷。在流行病學史不詳的情況下，根據臨床表現、輔助檢查和實驗室檢測結果做出診斷。

5.1.1 疑似病例符合登革熱臨床表現，有流行病學史(發病前15d內到過登革熱流行區，或居住地有登革熱病例發生)，或有白細胞和血小板減少者。

5.1.2 臨床診斷病例符合登革熱臨床表現，有流行病學史，并有白細胞、血小板同時減少，單份血清登革病毒特異性IgM抗體陽性。

5.1.3 確診病例疑似或臨床診斷病例，急性期血清檢測出NS1抗原或病毒核酸，或分離出登革病毒或恢復期血清特異性IgG抗體陽轉或滴度呈4倍以上升高。

5.2 重癥登革熱的診斷有下列情況之一者：(1)嚴重出血包括皮下血腫、嘔血、黑便、陰道流血、肉眼血尿、顱內出血等；(2)休克；(3)重要臟器功能障礙或衰竭：肝臟損傷(ALT和/或AST＞1000IU/L)、ARDS、急性心功能衰竭、急性腎功能衰竭、腦病(腦炎、腦膜腦炎)等。

5.3 鑒別診斷登革熱的臨床表現多樣，注意與下列疾病相鑒別。與發熱伴出血疾病如基孔肯雅熱、腎綜合征出血熱、發熱伴血小板減少綜合征等鑒別；與發熱伴皮疹疾病如麻疹、蕁麻疹、猩紅熱、流腦、斑疹傷寒、恙蟲病等鑒別；有腦病表現的病例需與其它中樞神經系統感染相鑒別；白細胞及血小板減低明顯者，需與血液系統疾病鑒別。

6 實驗室檢查[6,29]

6.1 一般檢查

6.1.1 血常規白細胞總數減少，多數病例早期開始下降，第4～5d降至最低點，白細胞分類計數以中性粒細胞下降為主。多數病例有血小板減少，最低可降至10×109/L以下。

6.1.2 尿常規可見少量蛋白、紅細胞等，可有管型出現。

6.1.3 血生化檢查超過半數的患者轉氨酶、乳酸脫氫酶升高，部分患者心肌酶、尿素氮和肌酐升高等。丙氨酸氨基轉氨酶(ALT)和天門冬氨酸氨基轉氨酶(AST)呈輕中度升高，少數患者總膽紅素升高，血清白蛋白降低。部分患者可出現低鉀血癥等電解質紊亂；出凝血功能檢查可見纖維蛋白原減少，凝血酶原時間和部分凝血活酶時間延長，重癥病例的凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ減少。

6.2 病原學及相關檢查

6.2.1 病毒抗原檢測NS1是登革熱病毒感染的主要標志性抗原，登革病毒NS1蛋白在登革熱病人剛開始發熱直至臨床期結束時都可以被檢測，甚至在登革病毒IgM抗體尚不能被檢出的情況下，登革病毒NS1蛋白就可以在血清、尿液和腦脊液中被檢出，因此，登革病毒NS1蛋白的檢測在登革熱的早期診斷中具有重要意義，其局限性在于敏感性較低。

6.2.2 血清學檢測初次感染患者，發病后3～5d可檢出IgM抗體，發病2周后達到高峰，可維持2～3月；發病1周后可檢出IgG抗體，IgG抗體可維持數年甚至終生；發病1周內，在患者血清中檢出高水平特異性IgG抗體提示二次感染，也可結合捕獲法檢測的IgM/IgG抗體比值進行綜合判斷。

6.2.3 病毒分離登革病毒可從急性期病人血清、血漿、血細胞層或尸解臟器分離到，病毒分離培養是檢測登革病毒感染的金標準，能夠對急性期樣本進行確認，并能夠區分血清型。登革熱病毒的分離培養可通過活蚊、細胞或動物進行。活蚊(巨蚊和伊蚊)分離是目前最敏感的登革病毒分離方法，但對接種技術要求高。此外，也可利用哺乳動物細胞(BHK21、LLC-MK2)或乳鼠顱內接種作為登革病毒的分離培養方法。分離培養物可進一步利用間接免疫熒光法、RT-PCR或流式細胞術來檢測登革病毒的存在。

6.2.4 病毒核酸檢測與傳統的病毒分離培養方法相比，核酸檢測技術更為快速和敏感。對于登革病毒目前主要通過巢式反轉錄聚合酶鏈反應(巢式RT-PCR)檢測。但目前國外已有多篇文獻報道使用TaqMan Real-Time PCR方法檢測登革病毒，該方法敏感度高，特異性好，快速。TaqMan Real-Time PCR檢測登革病毒引物和探針序列見表1。

表1 Real-time PCR檢測登革病毒引物和探針序列[30]

7 結束語

登革熱已成為日益嚴重的全球性公共衛生問題，目前我國廣東省的登革熱防控形勢不容樂觀。由于沒有特異性針對登革熱的藥物和疫苗[31]，無法確切有效的針對病原體進行治療和免疫。加強對登革熱監測和控制消滅媒介伊蚊則是當前最有效的預防措施。希望各領域專家相互協作，通過對登革熱疫苗、抗病毒藥物以及早期診斷方法進行深入研究，提供更加有效的防控措施及治療方法，從而降低登革熱發病率及病死率。

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R373.3+3，R512.8

∶A

1674-1129(2014)06-0649-05

2014-10-13；

2014-10-28)

林迪，女，生于1987年10月，本科，技師，從事臨床微生物學檢驗。

孫長貴，男，生于1962年9月，碩士研究生導師，主任技師，教授。