江西省2009年至2012年甲型H3N2流感病毒耐藥性分析

李健雄，熊英，施勇，龔甜，周珺，徐剛

(江西省疾病預防控制中心，江西南昌330029)

·論著·

江西省2009年至2012年甲型H3N2流感病毒耐藥性分析

李健雄，熊英，施勇，龔甜，周珺，徐剛

(江西省疾病預防控制中心，江西南昌330029)

目的分析江西省2009-2012年甲型H3N2流感病毒M2以及NA基因的特點，掌握其耐藥情況，為臨床治療和疾病控制提供參考。方法從江西省流感監測網中隨機選擇19株甲型H3N2流感病毒，經核酸提取和one-step RT-PCR擴增M以及NA基因片段，雙向序列測定，采用DNAStar5.0和Mage4.0序列分析軟件分析M2以及NA基因特征以及耐藥性位點。結果19株毒株M2基因31位氨基酸均由絲氨酸(S)突變為天冬酰胺(N)；所有毒株NA蛋白催化活性位點和輔助位點均未發生氨基酸替換。結論19株毒株均對金剛烷胺類藥物耐藥，對流感病毒神經氨酸酶抑制劑藥物均敏感，但仍應加強對流感病毒的耐藥性監測。

甲型H3N2流感；M2；NA；耐藥性

甲型H3N2流感病毒是引起人類流感的甲型流感病毒的一個重要亞型，是上世紀第三次世界流感大流行的病原，在人群中流行近一個世紀，每次流感流行都給社會帶來嚴重的經濟損失,造成不同程度的人群超額死亡率[1,2]。目前，流感病毒藥物主要有針對M2蛋白的烷胺類藥物和神經氨酸酶抑制劑類藥物[3]，但此類藥的耐藥株不斷出現，并呈增加趨勢。為了解我省甲型H3N2流感病毒耐藥基因特征，本研究對江西省2009年至2012年分離的季節性H3N2流感病毒的NA基因和M2基因進行測序，分析我省甲型H3N2流感病毒的耐藥性特點。

1 材料與方法

1.1 標本來源采集監測醫院流感樣病例咽拭子標本或流感疫情病例咽拭子標本。

1.2 病毒分離采用狗腎傳代細胞(MDCK)進行病毒分離，根據細胞病變和微量血凝實驗方法(HA)來判斷是否有病毒存在。將HA滴度≥1∶8的標本采用血凝抑制方法(HI)進行流感病毒型別鑒定(MDCK和標準血清均由國家流感中心提供)。所有毒株均經國家流感中心復核鑒定。

1.3 病毒選擇選擇19株來自不同時間、不同流感監測醫院病例的咽拭子標本中分離到的甲型H3N2流感病毒，對其NA基因和M基因進行基因擴增和測序。

1.4 病毒RNA提取采用德國Qiagen公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑對含流感病毒的MDCK細胞培養液進行病毒RNA的提取。

1.5 引物M基因MF1∶5′-AGCAAAAGCAGGTAGATATTGAAAGA-3′;MR1027∶5′-AGTAGAAACAAGGTAGTTTTTTACTC-3′;NA基因NAFUc∶5′-TATTGGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGAGT-3′NAR1104∶5′-ATCCACACGTCATTTCCATCGTCA-3′由上海生工生物工程技術服務有限公司合成[4]。

1.6 RT-PCR擴增M基因和NA基因采用QIAGEN One Step RT-PCR Kit試劑盒進行RT-PCR反應。RT反應條件：60℃1min，42℃10min，50℃30mim，95℃15min。PCR循環如下：94℃40s，50℃40s，72℃1min30s，35次循環，72℃10 min。

1.7 核苷酸序列測定PCR產物送上海生工生物工程技術服務有限公司進行雙向測定。

1.8 序列分析核苷酸和氨基酸同源性以及遺傳進化分析采用DNAStar5.0、Mage4.0序列分析軟件，烷胺類藥物敏感參比株A/NewYork/55/2004的M2基因序列以及2009年至2012年疫苗株A/ Brisbane/10/2007(H3N2)、A/Perth/16/2009(H3N2)、A/ Victoria/361/2011(H3N2)的NA基因序列作為參比分析，序列收錄號分別為CY121126、CY116578、CY081429、KJ942682。

2 結果

2.1 M2基因核苷酸同源性及遺傳進化分析19株病毒的M基因擴增產物經純化、雙向測序、序列拼接后,均獲得246bp M2基因序列。經DNAStar5.0、Mage 4.0軟件分析，與烷胺類藥物敏感參比株(A/ NewYork/55/2004)的核苷酸序列進行比較，核苷酸序列同源性在98.4%～98.8%之間、氨基酸的同源性在95.1%～96.3%之間，而這19株病毒之間的M2基因核苷酸序列的同源性較高，達99.2%～100%；氨基酸序列的同源性達到97.6%～100%。在M2基因氨基酸序列的種系進化樹(圖1)上可見我省19株病毒在同一分支上。

圖1 M2基因氨基酸進化樹

2.2 M2基因耐藥性位點分析對影響烷胺類藥物敏感性的26、27、30、31和34位氨基酸進行了分析，所有19株病毒均發生了S31N的氨基酸替換,而26、27、30和34位均未發生變異，但是所有毒株均發生了T9R和N88D的突變。

2.3 NA基因核苷酸同源性及遺傳進化分析對PCR獲得的NA基因經核苷酸測序、序列拼接后，獲得每株病毒NA基因片段序列1332bp。經DNAStar5.0、Mage4.0軟件分析，這19株病毒之間的NA基因核苷酸序列的同源性為97.2%～99.9%；氨基酸序列的同源性為96.6%～99.8%。對NA基因氨基酸序列的種系進化樹(圖2)的分析發現，2009年、2010年的3株毒株、2011年的1株毒株和2009年～2010年疫苗株A/JiangxiDonghu/110/2011 (H3)、2010～2012年疫苗株A/Perth/16/2009(H3N2)在同一分支上，2011年毒株(除A/JiangxiDonghu/ 110/2011(H3))、2012年毒株和2012～2013年疫苗株A/Victoria/361/2011(H3N2)在同一分支上。

圖2 NA基因氨基酸進化樹

2.4 NA基因耐藥性位點分析對NA蛋白酶催化活性位點(R-118、D-151、R-152、R-224、E-276、R-292、Y-406、R-371位)氨基酸和輔助位點(E-119、R-156、W-178、S-179、D-198、I-222、E-227、H-274、E-277、N-294、E-425位)氨基酸進行了分析，所有毒株均未發生變異。

3 討論

目前臨床上用于流感治療的藥物主要有兩類，一類是金剛烷胺類藥物，包括金剛烷胺和金剛乙胺，這類藥物于上世紀60年代被發現，1966年美國FDA批準應用于應對H2N2流感病毒的感染[5]。但1966年Cochran等就在組織培養株中發現了耐金剛烷胺突變株[6]。另一類藥物是神經氨酸酶抑制劑,包括扎那米韋(zanamivir)、奧塞米韋(oseltamivir)、帕拉米韋(peramivir)和A-315675等，1993年最先研制獲得扎那米韋，1996年首次合成奧斯他韋(達菲)，2002年達菲獲準在中國推出[3]。該類藥物對于甲、乙型流感病毒均有效,NA抑制劑是目前許多國家建議使用的抗流感藥物。盡管神經氨酸酶抑制劑應用較晚，但是臨床研究很快發現了神經氨酸酶抑制劑的耐藥株。

M2蛋白是流感病毒M基因編碼的膜蛋白,具有離子通道活性。金剛烷胺類藥物是通過阻擾M2蛋白的離子通道，通過抑制病毒與宿主細胞膜的融合及病毒RNA的釋放來抑制甲型流感病毒的復制。金剛烷胺是最早用于抑制流感病毒的藥物，然而流感病毒極易對烷胺類藥物產生耐藥突變[7，8]，研究證明，耐藥株的產生與M2蛋白跨膜區部分氨基酸的突變有關,現已證實L26F、V27A、A30T、S31N、G34E位中的氨基酸只要有1個或1個以上的變異就會導致耐藥株的出現[9-11]。突變的病毒保持良好的遺傳特性，可以在人與人之間進行傳播[11],因此，對流感病毒耐藥性和突變位點進行及時的檢測和長期監測顯得尤其重要。本次研究中的19株病毒M2區氨基酸均發生了S31N的突變，說明所有毒株均對金剛烷胺類藥物耐藥，這與流感病毒對M2蛋白抑制劑(金剛烷胺類藥物)普遍耐藥的報道一致[12],而T9R和N88D的突變的意義尚不清楚，有待進一步研究。

流感病毒的神經氨酸酶(NA)是流感病毒NA基因編碼的主要表面糖蛋白，容易發生變異。NA蛋白屬于Ⅱ型膜蛋白，具有糖苷外切酶活性，它的作用是水解神經氨酸結合的底物，即宿主細胞膜上多糖受體末端的N-乙酰神經氨酸，使子代病毒從宿主細胞表面釋放和擴散。流感病毒神經氨酸酶的八個氨基酸(R-118、D-151、R-152、R-224、E-276，R-292、R-371和Y-406)作為酶催化活性位點直接作用底物或者作為維持功能的重要因素，而其他11個氨基酸(E-119、R-156、W-178、S-179、D-198、1-222、E-227、H-274、E-277、N-294和E-425)作為輔助位點[13]。神經氨酸酶抑制劑作用于酶催化活性位點或輔助位點[14]，通過競爭性地結合NA蛋白上的特定區域，使神經氨酸酶水解功能降低，從而阻礙子代流感病毒顆粒的擴散，可以有效地阻斷流感病毒感染、復制和傳播的過程。不同酶催化活性位點或輔助位點的變異可導致對不同神經氨酸酶抑制劑的耐藥，奧斯他韋耐藥株出現H274Y、R292K位的替換，扎那米韋耐藥株出現E119V、R292K的替換，帕拉米韋出現R292K位的替換，A-315675出現E119V的替換。本次研究顯示我省H3N2流感病毒NA基因在2010年發生了一定的變異，而我國在2010年也改變了疫苗株的代表株。對突變重要位點分析可知，所有毒株在各重要位點均未發生氨基酸的替換，提示我省H3N2流感對神經氨酸酶抑制劑是敏感的，與北京報道一致[15]。

世界衛生組織在1999年建立了耐藥性監測機構-NAIs抑制劑敏感性全球網絡(neuraminidase inhibitor susceptibility network,NISN),其目的是收集數據并監視耐藥性的出現,確定是否存在耐藥突變下的敏感性降低,并用于討論公共健康及可能出現的耐藥性監管問題，這突出了流感敏感性檢測的重要性。隨著流感病毒耐藥率的逐年上升,耐藥毒株的傳播也對我們提出了警示，對病毒耐藥性的監測顯得尤為重要,其對于流感疫情控制,指導臨床用藥具有重要意義。

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Resistant analysis of H3N2 influenza virus in Jiangxi provience during 2009-2012

LI Jianxiong,XIONG Ying,SHI Yong,et al.Jiangxi Provincial Center for Disease Control and Prevention,Nanchang 330029,China.

Objective To analyze the characteristics of M2 and NA genes of H3N2 influenza virus in Jiangxi provience during 2009-2012.Methods Nineteen strains of H3N2 influenza virus were randomly selected for detection and virus RNA were extracted.Fragments of M2 and NA genes were amplified by one-step RT-PCR and then were sequenced.The data obtained were analyzed with the software DNAStar5.0 and Mage4.0.Results All strains of H3N2 influenza virus had amino acid changed at site S31N in M2 gene.All strains of H3N2 influenza virus had no mutation in catalytic residues and framework residues of NA gene. Conclusions The 19 strains were resistant to amantadine,and sensitive to neuraminidase inhibitors,however,continuous resistance surveillance is also necessary for control and prevention of influenza.

H3N2 influenza;M2 gene;NA gene;Resistance

R737.1+3,R511.7,R446.62

A

1674-1129(2014)06-0667-03DOI∶10.3969/j.issn.1674-1129.2014.06.006

2014-09-01；

2014-10-08)

江西省衛生廳科技項目(編號：20112003)

∶李健雄，出生于1986年7月，碩士,技師,研究方向為病毒檢驗。