布魯菌常規檢測與結果分析

廖晚珍，曾令兵，胡妮婭，胡雪飛，彭衛華，孫愛娣，余陽，劉洋

(南昌大學第一附屬醫院檢驗科，江西南昌330006)

·論著·

布魯菌常規檢測與結果分析

廖晚珍，曾令兵，胡妮婭，胡雪飛，彭衛華，孫愛娣，余陽，劉洋

(南昌大學第一附屬醫院檢驗科，江西南昌330006)

目的探討簡便可靠實用的布魯菌早期檢出方法，為布魯菌病的及時診治提供依據。方法應用BACTEC 9120或BACT/ALERT 3D等系統進行血或骨髓培養，然后取陽性瓶增菌液轉種血平板和巧克力等平板，再經VITEK-2-Compact全自動微生物分析儀或API 20 E鑒定系統進行菌種鑒定。結果布魯菌在上述血培養儀的瓶中2～4d可獲得陽性生長物，經VITEK-2-Compact儀(或API 20 E鑒定系統)次日能得到鑒定結果。結論Compact鑒定儀(或API 20E鑒定系統)對布魯菌的鑒定簡單、可靠、經濟、實用，且不會漏檢和誤檢，是目前常規檢測布魯氏菌的可靠方法。

布魯菌；血培養；細菌鑒定儀；早期診斷

布魯菌病(Brucellosis，布病)是由布魯菌(Brucella)侵入機體引起世界性、多宿主感染的人獸共患傳染病[1]，以人類感染有關的動物主要是牛、羊、豬(國內則以羊為主)。近年來，布病的人畜疫情在我國和世界部分國家、地區都出現了回升勢頭，據國家疾病監測系統的病例統計顯示：人間布病病例報告逐漸上升，西北、東北某些省份、內蒙古流行相當嚴重，有些布病罕見的地區臨床報道也在增多，現已陸續覆蓋各地，而且布病所引起的臨床癥狀日趨多變，表現復雜，病情輕重不一，且多個系統受損。總之，特征性的病例現已較少見到，因而在一定程度上給臨床的早期診斷帶來不少困難。目前，布病的防控形勢越來越嚴峻。傳統的布魯菌或生物型鑒定主要依據CO2的生長要求、H2S、噬菌體裂解、硫堇、堿性復紅染料抑菌試驗和單項特異性血清(A、M和R血清)凝集試驗[2]，該分型方法是金標準，其缺點是操作復雜、時間長。近年來應用PCR方法檢測BCSP 31屬基因與AMOS種/型基因[3，4]即獲得屬、種特異條帶，但過程比較復雜，且受條件的限制而難以廣泛應用，不適合布病的臨床常規診斷。本研究采用美國BD公司與法國生物梅里埃公司的血培養系統先進行血液(或骨髓液等)的增菌培養，再利用純培養物經VITEK-2-Compact全自動微生物分析儀或API 20 E鑒定系統進行布魯菌的鑒定，該方法簡便、可靠、經濟、鑒定周期短，其結果能為臨床診斷布魯氏菌病提供依據。

1 材料與方法

1.1 簡要臨床資料病例1，岳XX，男，工人，35歲。主訴：反復發熱2個月，乏力1月余。2013年6月10日無明顯誘因出現發熱，最高時39℃，伴畏寒、咳嗽、咳痰。當時在本地醫院給予左氧氟沙星、阿奇霉素等抗炎4d，體溫正常后出院。8月14日患者又發熱，再入當地醫院，給予上述同樣的藥物治療，體溫正常后出院。9月22日再次發熱，最高時40.2℃，入我院感染科。當天給予地塞米松靜滴并送骨髓液培養，由于體溫仍高于38℃，又給予莫西沙星抗感染、恩替卡韋抗病毒治療，體溫正常后出院。出院后實驗室報告骨髓液中培養出馬爾他(羊)布魯菌。患者出院后3d又發熱，最高時39℃，再入我院。

病例2，李XX，男，工人，66歲。主訴：反復發熱1個月。2013年7月中旬出現不明原因發熱，以中午、夜間為主，體溫38.5℃，伴有大汗，入我省某省級人民醫院，住院期間血培養陽性(但未鑒定出布氏菌)，臨床只好以一般革蘭陰性桿菌感染予以左氧氟沙星治療，體溫正常后出院。7月下旬患者又發熱，因未作任何處置，體溫一直在38℃上下，8月12日入我院中醫科，16日抽取骨髓液培養，22日報告培出馬爾他布魯菌，轉感染科治療。

病例3，譚XX，男，學生，15歲。主訴：發熱40余天，淺表淋巴結腫大10余天。2013年6月初患者出現不明原因發熱，熱形不規則，最高時39.8℃，自行服感冒藥癥狀無改善，遂當地診所予以抗感染治療后體溫降至正常(用藥不詳)，但有反復。6月29日家屬發現患兒頸部、腋窩多個腫大淋巴結，至本縣中醫院診治，并予以抗感染治療(用藥不詳)，體溫仍反復。7月5日至我院就診，門診以“發熱待查”收入感染科。入院后曾考慮淋巴瘤(彩超證實頸部、腋下、鎖骨上、腹股溝有腫大淋巴結)送淋巴結活檢和抽血液培養，同時給予頭孢西丁抗感染等，但患兒7月9日仍發熱，最高時39.2℃，口服退熱藥能降至正常，但易反復，7月10日送骨髓液培養并行頭孢噻肟治療，3天后體溫正常，7月15日淋巴結病理報告為慢性炎癥、排除淋巴瘤。7月16日再次發熱，當日血液和骨髓液培養均報告為培養出馬爾他布魯菌。追問病史，患兒曾有羊接觸史。

病例4，李XX，女，農民，53歲。主訴：反復發熱。2012年4月初開始連續發熱20余天，最高時39℃，治療后體溫正常(用藥不詳)。7月1日患者又發熱，最高時39℃，多數于午后或下午，可持續約10小時才能自行降至正常。因診斷不清，于7月6日以“發熱待查”收入我院感染科。入院后給予莫西沙星和安乃近與雙氯芬酸鈉栓治療，但仍有發熱。由于發熱原因不明，且三系減少、脾腫大等需要進一步檢查，但又涉及到費用和檢查風險，患者要求出院。出院后不久又發熱，最高時39℃，8月15日再入我院，16日送骨髓培養，22日報告培養出馬爾他布魯菌，追問病史，患者既往有服用未消毒牛奶和羊奶史。

病例5，李XX，女，學生，22歲。主訴：發熱半個月。2012年4月18日出現發熱，最高時41℃，一般午后逐漸升高，伴畏寒等不適，當時入本地縣醫院給予頭孢哌酮/他唑巴坦點滴，但仍發熱。5月2日入我院感染科，3日體溫39.2℃，抽取血液和骨髓液送培養，同時給予頭孢哌酮鈉2.0g靜脈點滴(Bid)，仍高熱(39.8℃)，后改用美羅培南0.5gQ8h，體溫降至38.4℃，5月10日血液和骨髓液均培養出馬爾他布魯菌(此前4月24日當地縣醫院培養為陰性)。追問病史，患者既往有羊接觸史和食羊肉史(后來其父親和妹妹都檢出布魯菌)。

病例6，陳XX，女，52歲，工人。主訴：反復發熱4個多月。2013年6月27日突然發熱，39.5℃，畏寒。自行服感冒藥后會大量出汗，然后體溫降至正常，但停藥后又上升，再服感冒藥，體溫又下降。如此反復1周病情不見好轉后于7月4日入當地市級醫院并給予頭孢曲松鈉靜滴，治療無效后改用阿莫西林/克拉維酸鉀與克林霉素治療4d后熱退，此后體溫正常。8月上旬患者又發熱，39℃以上，又行上述藥物治療5d后熱退，此后體溫一直穩定。10月上旬患者出現關節痛并發熱，39℃以上，繼續上述藥物治療5d后，體溫又恢復到正常。11月5日再次發熱，39℃，入我院風濕免疫科治療，同時送骨髓液和血液培養，考慮到患者有關節痛和發熱，還是給予激素和抗風濕治療，11月11日骨髓液和血液均培養出馬爾他布魯菌。

上述6例中男性3例、女性3例，已婚4例、未婚2例，工人3例、農民1例、學生2例，年齡15~66歲，均有反復發熱，最長4個月、最短半個月，最初發熱時均無明顯誘因，大部分呈高熱(5例39℃~41℃，1例38.5℃)。6例中1例有羊接觸史及全身淋巴結腫大，1例有服用未消毒牛奶和羊奶史，1例有羊接觸和食羊肉史(其父親與妹妹都檢出布魯菌)。6例經病原學確診后即按WHO的標準治療方案以多西環素、利福平治療后痊愈。

1.2 細菌培養與鑒定由病房護士以無菌技術抽取靜脈血液注入BACTEC 9120含樹脂需氧培養瓶或BACT/ALERT 3D需氧中和抗生素培養瓶中，每瓶5~10ml(骨髓液則由醫生抽取2~3ml)，培養瓶送至微生物室并及時放入血培養儀中，待陽性報警后再抽取瓶中標本接種血平板、巧克力等平板以及涂片革蘭染色，平板放置5%二氧化碳環境孵育24~48h，然后挑取純培養物進行第二次涂片染色并調至所需濃度上機進行菌株鑒定，儀器與相關配套材料為法國生物梅里埃公司的VITEK-2-Compact與GN-21341卡。鑒定儀按ISO 15189認證標準，每月采用ATCC25922、ATCC25923、ATCC 27853、ATCC 700323、ATCC 700603、ATCC 700327對檢測儀進行室內質控。

1.3 分子生物學檢測隨機抽取6株菌中1株菌(即病例1)作為分子生物學的檢測標本。DNA提取：抽取經VITEK-2-Compact儀器鑒定為布魯菌純培養物接種巧克力平板，培養48h后采用煮沸法提取細菌核酸。BCSP 31-PCR法菌屬鑒定：采用布魯菌屬特異性基因BCSP-31作為定屬基因，按照文獻[5，6]提供的引物序列和參數進行BCSP-PCR檢測。AMOS-PCR法菌種鑒定：采用文獻[7]提供的以布魯菌屬插入系列IS711為基礎建立的牛(A)、羊(M)、綿羊附睪(O)、豬(S)種布魯菌多重PCR (AMOS-PCR)進行種鑒定(陽性對照菌株與PCR相關試劑分別購自中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所與大連寶生物工程有限公司)。

2 結果

2.1 細菌培養與鑒定結果血液或骨髓液接種血培養瓶后一般3～4d出現較明顯的細菌生長(儀器陽性報警)，轉種血平板、巧克力平板48h后可見大小約0．5mm、圓形、邊緣整齊、無色半透明、呈露滴狀、折光明亮、表面光滑濕潤、稍隆起、均質樣菌落。革蘭染色為陰性短小桿菌，多為單個、少數呈雙排列，菌落、菌體形態符合布魯菌。挑取巧克力平板菌落接種GN-21341卡上機并過夜后儀器自動判讀為馬爾他布魯菌(6株布魯菌經江西省CDC布魯菌虎紅玻片凝集試驗均為陽性，即試管凝集試驗效價1：200～1：400)。

2.2 分子生物學檢測結果采用分子生物學方法對其鑒定，布魯菌屬特異BCSP-31-PCR檢測出225bp的特異條帶(圖1)，種特異AMOS-PCR鑒定為羊種布魯菌(圖2)，與上機鑒定結果完全一致。

3 討論

布魯菌病過去多見于牧區，近年來農村和城市的病例也在增多。該病的臨床表現多樣，除了間斷發熱，特殊癥狀和體征較少。因此，必須與其他發熱性疾病相鑒別，從患者感染標本中分離出布魯菌為確診的依據。漏檢和錯報都將給診治帶來嚴重的后果。本研究中病例2、5就是兩個典型病例。病例2，2013年7月中旬在我省某省級人民醫院住院時(即第一次發熱)血培養呈陽性，本來很有診斷價值，但該院微生物室未能鑒定出布魯菌，只報告為“培養出陰性桿菌”的報告，導致臨床按一般革蘭陰性桿菌敗血癥治療。病例5也存在類似的問題，患者2012年4月18日開始發熱，但4月24日的血培養報告為陰性，該“陰性”結果是否與患者用藥(頭孢哌酮/他唑巴坦)、采血時機等因素有關，還是檢驗人員自身的問題，現已不得而知。

圖1 布病患者隨機抽樣分離菌株BCSP31-PCR結果

圖2 布病患者隨機抽樣分離菌株AMOS-PCR結果

對于布病，除在發熱期應盡早抽血液或骨髓外，其他標本如尿液、腦脊液、乳汁等也應盡量做細菌培養與鑒定。而病例6，患者不明原因發熱4個多月，在當地市級醫院住院時，有條件做培養而未做血液與骨髓培養，結果導致診斷和治療不及時。從該患者在我院的血培養情況看，如果按照常規設置即血培養瓶放置血培養儀中5d不報警為陰性，并且不做盲傳就報告無菌生長的話，這份血標本肯定漏檢。而實際情況是，患者11月上旬抽血做培養，5d中儀器無陽性報警，考慮到該患者的特殊性，仍轉種血、中國藍、巧克力平板。但2d內血、巧克力平板未生長細菌(中國藍平板本來就不生長)。出現這種情況，我們推測患者較長時間、反復多次、大量使用抗生素，細菌的生長已受到了影響。因此，當血培養瓶為陰性時，應延長培養時間。另外，血平板、巧克力平板不長菌時也應延時，并在1d、2d、3d甚至更長時間內每天觀察菌落生長情況。

從病例1、3、4來看，盡管不存在病原學檢測的問題，但臨床診治上仍有不足。如病例1，該患者二、三個月內反復出現高熱，并有養羊史，應考慮布病，尤其是已經懷疑患者有布病時，住院期間應積極詢問并關注骨髓培養的結果和相關方面的信息，而不是體溫一下降就囑其出院，結果導致患者再次發熱重返醫院，增加了病人的痛苦和經濟負擔，更重要的是失去最佳的治療時機。而病例3臨床主要被患者全身腫大的淋巴結所迷惑，而考慮淋巴瘤。但是，病史詢問不全面，等到淋巴結報告為炎性、血液和骨髓液培養都報告為馬爾他布魯菌之后才去追問患兒有無羊接觸史，似乎太晚。此外，發熱性的病種考慮得太局限也是影響診斷的一個因素。病例4主要是患者本身的問題導致診斷與治療受到了影響。布病最具特征性的表現為反復發熱、尤其是高熱的特點，本文的6個病例其臨床表現也是如此，少則2次、多則5次，一般都有2～3次高熱過程。未確診前醫生都不會輕意使用對細胞壁有穿透力的藥物，一旦確診又必須使用這類藥物，因為布魯菌系細胞內寄生性致病菌，臨床一般首選多西環素(強力霉素)與利福平的聯合，或利福平聯合四環素、利福平聯合鏈霉素或鏈霉素聯合多西環素。次選磺胺增效劑(TMP/SMZ)。復方磺胺甲噁唑片也有效，但復發率30%，而利福平聯合多西環素復發率僅5%，復發病例采用利福平聯合多西環素治療仍然有效。對于孕婦布病首選利福平，若無效可單獨給予四環素或甲氧芐胺嘧啶，忌用鏈霉素。由于布病病程長，無論采用上述哪種方案，用藥時間至少6周。實踐證明，布病只要正規用藥一般都能治愈。反之，使用其他抗生素治療毫無效果，本文的6個患者都先后、分別使用過青霉素類的阿莫西林/克拉維酸鉀，喹諾酮類的環丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星，頭孢菌素類的頭孢西丁、頭孢哌酮、頭孢哌酮/他唑巴坦、頭孢曲松，碳青霉烯類的美羅培南，大環內酯類的阿奇霉素，克林霉素類，激素類的地塞米松，抗病毒類的恩替卡韋，抗感冒藥和退熱藥等，無論臨床使用多長時間(如病例4莫西沙星就連續靜滴12天)、多大劑量、一次還是多次、一種單用還是多種聯用都無法殺滅布魯菌，只能暫時降低患者的體溫。一旦停用，又會反彈。布病治療的失敗往往不是布魯菌對藥物有抗性，而是選藥不當或療程不足，尤其是因癥狀減輕而擅自終止用藥所致。本研究還證明，布病的關鍵在于診斷，診斷的關鍵在于病原學，而病原學的關鍵在于血液(或骨髓液)的培養與分離，然后是準確的鑒定。血液是最常用的標本，而且急性期培養陽性率很高。目前醫院主要依靠VITEK-2-Compact和API 20 E，而VITEK-2-Compact以外的型號，如：VITEK 32等、ATB以及BD Phoenix-100與DADE BEHRING Microscan walk-Away 40 SI系列儀器等無法檢出布魯菌。因為這些儀器的細菌鑒定名錄數據庫中沒有布魯菌屬，所以無法鑒定出布魯菌，而VITEK-2-Compact是新一代的全自動快速微生物鑒定智能分析系統，優化和擴大了微生物數據庫。我們查閱了近3年國內報道的若干布魯菌病例，均由該儀器鑒定得出。至于API系統，作為細菌鑒定的金標準，Dhar等[8]早就采用API 20E板條鑒定出布魯菌屬。因此，沒有VITEK-2-Compact儀或不使用API 20 E系統進行檢測就有可能漏檢。一旦漏檢，臨床就無法診斷和治療，這對患者和疫情的控制都將帶來嚴重的后果。但血培養系統無論采用BACTEC 9120還是BACT/ALERT 3D等都能在3～4d培養出布魯菌。布魯菌屬于第2類病原體，應在三級生物安全實驗室中進行檢驗。但上述病例的出現表明，在二級生物安全實驗室的日常臨床檢驗過程中肯定會遇到攜帶布魯菌的標本。而在實際工作中，微生物室檢驗人員未必能及時了解患者的病史及疫情接觸史。因此如何盡早發現攜帶布魯菌的標本，這是做好檢測與防護、特別是防止實驗室工作人員布魯菌感染發生的關鍵。結合上述病例的檢測結果，我們認為：當血液(或骨髓液)等標本中的培養物直接涂片見到云霧狀革蘭陰性短小桿菌，轉種血平板、巧克力平板48h以上才有明顯細菌生長、且菌落無色、透明、濕潤、細小、氧化酶陽性，菌落涂片仍然為陰性短小桿菌，患者白細胞計數正常或偏低、但淋巴細胞升高時，應考慮標本中布魯菌存在的可能性。此時應加強與臨床的聯系，包括流行病學資料的收集。

對于布魯菌藥敏，目前還沒有推薦的方法，所以藥敏試驗可不作為常規檢測，只是在十分需要時才做，并建議使用稀釋法。

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Routine detection and analysis of Brucella

LIAO Wanzhen，ZENG Lingbing，HU Niya，et al.The First Affiliated Hospital of Nan Chang Uniuersity，Nanchang 330006，China

Objective To explore a reliable early detection method of Brucella for the early diagnosis and treatment of Brucellosis.Methods Specimens were cultured in Bactec 9120 or BACT/ALERT3D system,and then turned to the blood or chocolate plate to grow.Finally,picked single colony and inoculated into GN-21341 card,then identified strain with VITEK-2-Compact system(or cultured in API20E).Results Brucella has a significant growth in 2-4 days,by culturing in the two supporting systems shown above.Conclusions VITEK-2-Compact system(or API20E)is more simple,reliable,economical and practical than molecular biological or classical identification methods.In addition,this system would not miss any positive results,and is the only one automately routine testing of equipment models at present.

Brucella;Blood cultre;VITEK-2-Compact;Early detection

R446.5

A

1674-1129(2014)06-0670-04DOI∶10.3969/j.issn.1674-1129.2014.06.007

2014-10-18；

2014-11-05)

廖晚珍，男，出生于1952年，主要從事臨床細菌、真菌與分子生物學研究。