細菌培養法與核酸(熒光PCR法)檢測肺炎克雷伯菌的對比分析

楊劍，劉劍榮，黃永建

(萍鄉市人民醫院檢驗科，江西萍鄉337055)

·實驗研究·

細菌培養法與核酸(熒光PCR法)檢測肺炎克雷伯菌的對比分析

楊劍，劉劍榮，黃永建

(萍鄉市人民醫院檢驗科，江西萍鄉337055)

目的探討培養及核酸檢測兩種不同方法進行肺炎克雷伯菌檢測分析的相關性，為臨床提供及時準確的結果。方法對本院68例疑似肺炎克雷伯菌感染病人采集送檢的痰標本，采用細菌培養法及核酸(熒光PCR法)檢測，結果進行對比統計分析。同時對熒光PCR法的特異性和敏感性進行研究。結果在68例痰標本中肺炎克雷伯菌檢出的結果，常規細菌培養法檢出陽性33例，陰性35例，陽性率48.53%；熒光PCR法檢出陽性49例，陰性19例，陽性率72.06%。對肺炎克雷伯菌標本DNA檢測得擴增產物，對非肺炎克雷伯菌無交叉反應，其檢測敏感性為1×103copies/ml。結論熒光PCR法檢出肺炎克雷伯菌的陽性率高于常規細菌培養法，具有很高的敏感性和特異性，檢測時間短，能為臨床診斷提供及時準確的結果。

肺炎克雷伯菌；細菌培養法；熒光PCR法

克雷伯菌屬為腸桿菌科中一類有莢膜的革蘭陰性桿菌，本屬中肺炎克雷伯菌、臭鼻克雷伯桿菌和鼻硬結克雷伯菌與人類關系密切。其中肺炎克雷伯菌占克雷伯菌屬感染的95%以上。該菌存在于人類腸道、呼吸道以及水和谷物。當機體免疫力降低或長期大量使用抗生素導致菌群失調時，進入人體可引起肺炎、尿路感染、敗血癥、傷口感染、腦膜炎等多種疾病[1，2]。

近十來年發展的分子生物學技術，特別是聚合酶鏈反應(PCR)在臨床應用上越來越受到青睞，且不斷在推廣，使得臨床細菌感染后快速、準確診斷成為可能。本文對本院68例疑似肺炎克雷伯菌感染病人采集送檢的痰標本，通過細菌培養及核酸PCR檢測兩種不同方法對肺炎克雷伯菌進行檢測分析，比較兩種方法的相關性，同時對熒光PCR法的特異性和敏感性進行觀察，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源本院68例疑似肺炎克雷伯菌感染病人采集送檢的痰標本密閉送檢，同一患者標本多次分離同樣細菌按一株算。

1.2 儀器和試劑VITEK32全自動細菌分析儀鑒定，鑒定卡由生物梅里埃公司提供。肺炎克雷伯菌核酸測定試劑盒(熒光PCR法)由上海之江生物科技股份有限公司提供。本科室PCR實驗室已通過國家衛生部驗收。

1.3 方法

1.3.1 常規細菌培養檢測肺炎克雷伯菌將送檢的痰標本分別接種于血平板、巧克力平板、中國蘭平板、TTC-沙氏。放于37℃培養箱培養。巧克力平板置5%CO237℃培養箱培養。培養18～24h后做進一步鑒定。并用標準株大腸埃希菌ATCC25922作為質控株[3]。嚴格按照《全國臨床檢驗操作規程》第3版操作[4]。

1.3.2 核酸檢測(熒光PCR法)嚴格按照肺炎克雷伯菌核酸測定試劑盒(熒光PCR法)說明書進行操作。包括標本、對照品的核酸裂解處理，試劑配制，加樣，PCR擴增，閾值設定，質量控制，試驗結果計算。進行定量檢測時，陽性參考品(1×107copies/ml)進行10、100和1000倍梯度稀釋，試驗結束后，儀器自動生成標準曲線。

1.3.3 特異性試驗將培養為肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、化膿性鏈球菌、白念珠菌的痰標本分別用肺炎克雷伯菌核酸測定試劑盒(熒光PCR法)進行DNA提取檢測。

1.3.4 敏感性試驗將肺炎克雷伯菌陽性參考品(1×107copies/ml)進行10倍梯度稀釋成：106copies/ ml、105copies/ml、104copies/ml、103copies/ml、102copies/ml、101copies/ml，然后進行DNA提取檢測[5]。

1.4 統計學方法分析兩種方法的陽性檢出率比較采用四格表資料的χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學差異。

2 結果

2.1 肺炎克雷伯菌檢出情況在68例痰標本中肺炎克雷伯菌檢出的結果，常規細菌培養法檢出陽性33例，陰性35例，陽性率48.53%；熒光PCR法檢出陽性49例，陰性19例，陽性率72.06%。熒光PCR法檢出肺炎克雷伯菌的陽性率高于常規細菌培養法。未發現細菌培養陽性而熒光PCR法擴增陰性標本。見表1。

表1 兩種方法對68例痰標本檢測肺炎克雷伯菌陽性率比較

經統計學方法處理，χ2=3.93＞3.84=χ20.05(1)，P＜0.05，陽性檢出率的差異具有統計學意義。

2.2 特異性試驗培養為肺炎克雷伯菌的痰標本進行DNA提取后，PCR方法檢測得7.06× 106copies/ml；而非肺炎克雷伯菌的痰標本結果為低于檢測下限(＜500copies/ml)。表明熒光PCR法具有良好的特異性。

2.3 敏感性試驗分別選取濃度為106copies/ml、105copies/ml、104copies/ml、103copies/ml、102copies/ ml、101copies/ml的標本進行DNA檢測，結果最低可檢出1×103copies/ml，與試劑說明書中產品性能指標的最低檢測限：1×103copies/ml相符。

3 討論

目前，肺炎克雷伯菌是重要的條件致病菌和醫院感染病原菌之一，多見于年老體弱或原有慢性支氣管-肺疾患者，亦可通過機械呼吸器、霧化器或各種導管而感染，筆者采用細菌培養法和熒光PCR法對肺炎克雷伯菌進行檢測對比分析。結果表明，PCR檢測的陽性率高于常規細菌培養法，且經統計學分析，兩法有差異，具有統計學意義。同時結果表明熒光PCR法具有很高敏感性和特異性，與有關報道相符[6]。

培養法一直被認為是檢測細菌最可靠的方法，但該方法操作復雜、技術要求嚴格、費時；而細菌熒光定量PCR檢測技術具有很高的敏感性和特異性，不受細菌存活與否的限制，近年來廣泛應用臨床標本檢測,但該方法對實驗條件和檢查技術要求較高，又因敏感性較高，容易受外界污染的影響而產生假陽性[7]。本實驗中49例PCR陽性結果的標本，筆者認為不排除存在假陽性的可能。但未發現細菌培養陽性而熒光PCR法擴增陰性標本。然而，PCR檢測的陽性率明顯高于常規細菌培養法，分析原因可能還有：(1)采集標本細菌量少，加之雜菌生長迅速所覆蓋；(2)患者采樣前已使用過抗菌藥物，抗菌藥物抑制了細菌生長，導致培養結果陰性[5]。

肺炎克雷伯菌培養法一直是診斷克雷伯菌性肺炎的最可靠的方法，仍是目前主要的檢測手段。但細菌培養所需時間較長，對疾病的的診斷有一定的滯后。熒光PCR法核酸檢測具有不受病程影響、快速、敏感性和特異性高的優點[8，9]，作為一項常規實驗室檢查發出報告只需要4h[10]，可以及時為臨床提供病原學的診斷結果。雖然PCR能較早檢出病原菌，但不能進行抗菌藥物的體外敏感試驗，其在臨床的應用還是受到一定的限制。加上PCR法要求在合格的PCR室進行，具有一定的局限性。但熒光PCR法是目前臨床上檢測克雷伯菌性肺炎的最佳方法之一，有條件的醫院可以開展。

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[3]馬麗敏,廖致紅.重癥監護室和普通病產房ESBL肺炎克雷伯菌的耐藥性對比[J].臨床醫學工程,2012,19(4)∶598-599.

[4]葉應嫵,王毓三,申子瑜.全國臨床檢驗操作規程[M].第3版.南京∶東南大學出版社,2008∶809.

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Comparison between bacterium culture and real-time PCR in detection of Klebsiella pneumoniae

YANG Jian,LIU Jianrong HUANG Yongjian.Department of Clinical Laboratory,Pingxiang People’s Hospital,Pingxiang Jiangxi 337005,China

Objective To compare the correlation of bacterium culture and real-time PCR for Klebsiella pneumoniae detection.Methods A total of 68 suspected-infection sputum samples were taken and analyzed by both bacterium culture and realtime PCR to detect Klebsiella pneumoniae.The sensitivity and specificity of real-time PCR were also analyzed.Results The detection rate of Klebsiella pneumoniae by real-time PCR was significantly higher than that by bacterium culture[72.06%(49/68)vs. 48.53%(33/68),P＜0.05].The sensitivity of real-time PCR was 1×103copies/ml and there were no cross reactions with Klebsiella pneumoniae.Conclusion The positive rate of real-time PCR was higher than bacterium culture.The high sensitivity and specificity and the rapid turnaround time make real-time PCR valuable for effective clinical diagnosis.

Klebsiella pneumoniae;Bacterium culture;Real-time PCR

R446.5,R446.62,R378.99+6

A

1674-1129(2014)06-0692-02DOI∶10.3969/j.issn.1674-1129.2014.06.015

2014-08-25；

2014-09-17)

楊劍，女，1983年6月出生，學士學位，主管技師，研究方向為臨床免疫學和分子生物學檢驗。