獻血者HBV、HCV、HIV檢測模式探討

陳紅，劉春蘭，王亞彬，倪龍鳳

(九江市中心血站，江西九江332000)

·調查報告·

獻血者HBV、HCV、HIV檢測模式探討

陳紅，劉春蘭，王亞彬，倪龍鳳

(九江市中心血站，江西九江332000)

目的對獻血者樣本進行HBV、HCV、HIV的ELISA檢測、NAT檢測和確證試驗，在保證血液安全的前提下，選擇最佳的獻血者HBV、HCV、HIV的檢測模式。方法2003年9月1日至2014年8月31日九江血站采集的無償獻血樣本共43473例，用兩種ELISA試劑進行HBV、HCV和HIV檢測，檢測陰性樣本和單試劑陽性的樣本進行NAT檢測，單試劑樣本分別進行確證試驗。結果42161例ELISA陰性樣本有75例NAT陽性，陽性率0.18%；45例HBV單試劑陽性樣本有7例NAT陽性，有2例確認試驗陽性(其中1例NAT陽性)；18例HCV單試劑陽性樣本NAT未檢出陽性，確證試驗5例不確定；15例HIV單試劑陽性樣本NAT未檢出陽性，確證試驗1例不確定，追蹤為陰性。結論開展NAT檢測十分必要，但NAT檢測不能完全代替ELISA檢測，獻血者的HBV、HCV、HIV檢測模式選用一種ELISA試劑加一種NAT試劑檢測能最大限度地防止陽性樣本的漏檢，更好地保障血液安全。

ELISA檢測；核酸檢測；確證試驗；血液安全

DOI∶10.3969/j.issn.1674-1129.2014.06.053 2012年6月

衛生部頒布了新的《血站技術操作規程》[1]，獻血者乙型肝炎病毒(HBV)感染標志物、丙型肝炎病毒(HCV)感染標志物和人類免疫缺陷病毒(HIV)感染標志物的檢測方法可以用兩種不同生產廠家的酶聯免疫(ELISA)試劑或一種ELISA試劑加一種核酸擴增(NAT)試劑檢測。我國從2010年開始在血站進行病毒核酸檢測的試點工作，目前關于我國獻血者核酸檢測的功效仍在研究中[2]。現在很多血站在采用兩次ELISA后再加做一次NAT，檢測成本巨大。本站通過對獻血者樣本進行HBV、HCV、HIV的ELISA檢測、NAT檢測和確證試驗，在保證血液安全的前提下，選擇最佳的獻血者HBV、HCV、HIV的檢測模式。

1 材料與方法

1.1 材料2013年9月1日-2014年8月31日九江地區無償獻血者共計43473例，體檢合格后采血，同時留取2管5±1ml樣本，其中1管用EDTAK2抗凝的真空采血管，用于ELISA檢測，1管用無菌、無DAN酶、無RNA酶、帶分離膠的EDTA-K2抗凝BD真空采血管，用于核酸檢測。所有樣本在2～8℃保存，1600g離心20min，48h內完成ELISA和NAT檢測。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 ELISA試驗乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑(英科新創科技有限公司、北京萬泰生物藥業股份有限公司、珠海麗珠試劑股份有限公司)、丙型肝炎病毒抗體診斷試劑(英科新創科技有限公司、北京萬泰生物藥業股份有限公司)、人類免疫缺陷病毒HIV1/2抗體診斷試劑(上海實業科華生物技術有限公司)，人類免疫缺陷病毒HIV1/2抗原抗體診斷試劑盒(珠海麗珠試劑股份有限公司)，試劑均通過中國藥品生物制品檢定所批批檢合格，且在有效期內使用；檢測用澳斯邦全自動加樣儀STAR和全自動酶免儀FAME完成，在校驗期內使用。

1.2.2 核酸試驗乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒(1+2型)核酸聯合檢測試劑(羅氏診斷產品有限公司)，在有效期內使用；檢測用美國羅氏Cobas S201全自動核酸檢測系統(包括Hamilton STAR全自動混樣儀、Cobas Ampilprep核酸提取儀和Cobas Taqmen Analyzer核酸擴增檢測儀)完成，在校驗期內使用。

1.2.3 確認試驗乙型肝炎病毒表面抗原確認試劑(珠海麗珠，批號2014060248)、丙型肝炎病毒抗體確證試劑(北京萬泰，批號RC20140101)、人類免疫缺陷病毒HIV1/2抗體確證試劑(MP生物醫學亞太有限公司,批號AE3031)，在有效期內使用。

1.3 方法

1.3.1 ELISA試驗用2種ELISA試劑進行HBV、HCV、HIV檢測，每次檢測嚴格按試劑說明書操作，陰陽性對照成立，室內質控在控。任何1種試劑S/ CO值≥1.0為反應性,0.85≤S/CO值＜1.0為灰區，任一種試劑檢測為反應性或灰區的，則重取血袋導管血雙試劑雙孔平行復試，復試后任1種試劑任1孔呈反應性或灰區的，判為陽性。

1.3.2 核酸試驗淘汰ELISA試驗雙試劑陽性的樣本，陰性和HBV、HCV、HIV單試劑陽性的樣本由全自動混樣儀自動混樣，每6份樣本(167μl/份)混合成1份(1ml)作為一級混樣池(pool)樣本,由全自動核酸提取儀和全自動核酸擴增檢測儀采用核酸定性篩查試劑進行HBV-HCV-HIV NAT檢測。每批檢測均設置1個陰性質控和5個陽性質控，每個pool均含內對照。pool檢測為陰性，6份樣本合格；pool檢測為反應性，對該pool中的6份樣本進行單份拆分檢測，拆分試驗為陰性判定為NAT檢測陰性，反之拆分試驗為反應性判定為NAT檢測陽性。陽性的樣本委托羅氏公司做鑒別試驗。

1.3.3 確認試驗HBV單試劑陽性的樣本進行確認檢測(中和試驗)，樣本的抑制率≥50%，判為陽性；HCV單試劑陽性的樣本進行確證檢測(重組免疫印跡法RIBA)，至少出現2種HCV抗體特異條帶(Core、NS3、NS4、NS5)強度1+及以上判為陽性，僅出現1種HCV抗體特異條帶強度1+及以上判為不確定；HIV單試劑陽性的樣本進行確證檢測(免疫印跡法WB)，至少有2條ENV帶(gp160/gp41和gp120)，或1條env帶和p24帶同時出現判為陽性，出現HIV抗體特異帶，但不足以判陽性的則判為不確定[3]。

2 結果

2.1 43473例樣本經ELISA檢測有42161例陰性樣本和78例單試劑陽性樣本，其中HBV單試劑樣本45例，HCV單試劑樣本18例，HIV單試劑樣本15例。

2.2 核酸檢測42161例陰性樣本拆分后有75例陽性，經鑒別試驗有44例為HBV陽性，無HCV和HIV陽性；78例HBV、HCV、HIV單試劑陽性樣本，拆分后有7例陽性，經鑒別試驗有6例為HBV陽性，無HCV和HIV陽性。

2.3 78例單試劑陽性樣本NAT或確認試驗陽性判為陽性結果見表1。

表1 78份單試劑陽性結果

3 討論

42161例ELISA檢測陰性樣本，經核酸檢測，檢出75例陽性樣本，陽性率為0.18%，高于德宏地區0.098%[4]和常州地區(0.1%)[5]，但低于龍巖地區0.24%[6]。45例HBV單試劑陽性樣本，核酸檢測7例陽性，18例HCV單試劑陽性樣本和15例HIV單試劑陽性樣本，核酸未檢出陽性。核酸檢測陽性樣本共82例經核酸鑒別試驗，有51例為HBV陽性，未檢出HCV和HIV陽性，陽性率為62.2%，與濟南地區63.86%[7]和東莞地區65.38%[8]相近。分析原因，可能是：(1)我國是HBV高流行國家，雖然HBV計劃免疫在我國取得了重大成效，但HBsAg在1~59歲普通人群中的流行率仍高達5.84%[9]，所以HBV的檢出率較高；(2)HBV是DNA病毒，對于外界環境的抵抗力較強，而HCV和HIV均是RNA病毒，對溫度較敏感，相對穩定性差，易降解，造成HCV和HIV無法檢出；(3)在核酸檢測過程中由于擴增產物、氣溶膠、人為操作等原因造成核酸檢測結果的假陽性；(4)由于我們樣本數量不夠大，所以未檢出HCV-RNA和HIV-RNA陽性的樣本。以上數據說明由于“窗口期”、靈敏度、亞型、病毒變異以及免疫靜默感染等方面原因，ELISA檢測存在局限性，NAT檢測能有效縮短病毒檢測窗口期，檢測隱匿性的病毒感染及病毒變異株等，彌補ELISA檢測的不足。

我們對HBV、HCV、HIV單試劑陽性樣本分別用中和、RIBA和WB試驗確證。45例HBV單試劑陽性樣本有2例陽性，其中1例核酸檢測陽性；18例HCV單試劑陽性樣本有5例不確定，核酸未檢出；15例HIV單試劑陽性樣本有1例不確定，核酸未檢出，經追蹤此樣本檢測結果同前，因此可以排除HIV陽性。結果表明，NAT試驗雖能檢出部分ELISA漏檢的樣本，但由于檢測系統靈敏度、樣本病毒載量低、病毒在樣本中的不規則分布和核酸檢測抓取病毒的隨機性等原因，有可能導致NAT檢測存在假陰性，所以NAT檢測不能完全代替ELISA檢測，同時核酸實驗室的規范化、標準化和精細化管理是十分重要的[10]。

綜上所述，筆者認為開展NAT檢測十分必要，獻血者的HBV、HCV、HIV檢測模式選用一種ELISA試劑加一種NAT試劑檢測能最大限度地防止陽性樣本的漏檢，更好地保障血液安全，這與江西省血液中心的相關報道一致[11]。但任何的檢測試劑都存在靈敏度和特異性的問題，如何選擇最佳的ELISA試劑和NAT試劑的組合，將是我們下一步需要研究的。

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R193.3，R446.62，R512.91，R512.63，R512.62

A

1674-1129(2014)06-0778-02

2014-09-15；

2014-10-24)

江西省九江市科技局課題項目(編號∶[2013]50-19)