負載卵清蛋白的樹突細胞體內回輸對過敏性哮喘的影響

李 飛，藺麗慧，王 娟，李 佳，彭 霞，肖 輝，劉亞楠，戴慧蓉，王玉萍，李 莉

過敏性哮喘是一種以肺部嗜酸粒細胞浸潤、黏液分泌增加和氣道高反應性為特征的慢性氣道性疾病，發病機制復雜，其中Ⅰ型超敏反應被認為是其主要機制，現已發現多種細胞參與此過程，如樹突細胞、T細胞、B細胞以及肥大細胞[1]。樹突細胞是來自骨髓的一群異質細胞，分布于大多數外周組織中。位于鼻、氣管、支氣管、肺泡和臟層胸膜在內的整個肺組織的樹突細胞能主動捕獲、加工處理外來抗原，并由主要組織相容性復合體Ⅱ類分子(MHCⅡ)完成抗原提呈，一旦其進入發育成熟階段即失去這種捕獲能力；與此同時進入成熟階段的樹突細胞在形態和功能方面發生巨大變化，其表面MHC、協同刺激分子和黏附分子表達增多，導致樹突細胞激活T細胞的能力增強，進而引起免疫應答[2]。樹突細胞作為目前已知的體內功能最強的專職抗原遞呈細胞在此過程中占據關鍵地位[3]。

此前對于哮喘的研究多集中在Th1/Th2平衡和肥大細胞脫顆粒等方面[4]，但對于樹突細胞在過敏性哮喘發病中所發揮的作用卻少有報道。有研究表明哮喘患者外周血中樹突細胞的比例和絕對數量均有不同程度的升高[5]。本實驗擬通過尾靜脈注射樹突細胞,然后致敏和激發，觀察小鼠的生命狀態、脾臟的增生情況、肺泡灌洗液中的組胺水平、肺組織炎性反應情況，進一步揭示樹突細胞在哮喘發病中發揮的作用，為哮喘的預防和治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑及儀器 雄性BALB/c(H-2d)小鼠30只，6～8周齡，體質量20～25 g，購自上海必凱實驗動物中心,飼養在SPF級實驗動物飼養設施中。RPMI 1640全培養液〔含RPMI 1640培養基(GIBCO公司)、10%胎牛血清(GIBCO公司)、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素及50 μmol/L 2-巰基乙醇(Amerco公司)〕。紅細胞裂解液由本室配制。重組小鼠粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(rmGM-CSF)及重組白介素4(rmIL-4，Peprotech公司)，脂多糖(LPS)和二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司)，CCK-8試劑盒(Cell Counting Kit-8，Dojindo公司)。熒光抗體:抗小鼠CD11c抗體，抗小鼠MHC Ⅱ抗體，抗小鼠CD86抗體(Biolegend公司)。流式細胞儀FC500(Beckman Coulter公司)，倒置顯微鏡(Olympus公司)。恒溫培養箱(SANYO MCO-175)，酶標儀(Thermo MK-3)。

1.2 骨髓源性樹突細胞(BMDC)的培養 無菌取出骨髓細胞，裂解紅細胞，用RPMI 1640全培養液配成1×106cell/ml的單細胞懸液。接種于6孔培養板，每孔5 ml，加入rmGM-CSF(終濃度10 ng/ml)及rmIL-4(終濃度10 ng/ml)，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養。第4天時吸棄全部培養基，并沿培養板壁緩慢加入3 ml RPMI 1640,緩慢均勻搖晃培養板30 s，吸去培養基，重復洗滌1次，盡可能清除懸浮細胞。然后加入等量RPMI 1640全培養液和rmGM-CSF及rmIL-4，第7天輕輕吹打后收獲懸浮細胞[6]。部分實驗于第6天加入1 μg/ml LPS或者10 μg/ml OVA。

1.3 樹突細胞形態學觀察 于倒置顯微鏡下觀察樹突細胞的形態。

1.4 樹突細胞表面標志物檢測 收集培養的細胞約5×105個懸于100 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)，加入熒光素標記的各種單克隆抗體1 μl，4 ℃避光孵育30 min，離心去上清液，加入2 ml PBS清洗細胞1次，然后將細胞重懸于0.5 ml PBS，上流式細胞儀檢測細胞表面CD11c、CD86及MHCⅡ表達情況。

1.5 樹突細胞回輸及哮喘模型的建立 小鼠采用隨機數字表法分為3組，每組10只。健康對照組不做任何處理；哮喘組給予PBS，然后致敏和激發；OVA-DC干預組尾靜脈注射負載OVA的樹突細胞 1×106個,然后致敏和激發。哮喘組和OVA-DC干預組第1天給予干預，第7天、第14天分別腹腔注射0.2 ml OVA和氫氧化鋁〔Al(OH)3〕混懸液〔含20 mg OVA和2 mg Al(OH)3〕,第27、28、29天連續給予1% OVA混懸液霧化吸入，30 min/次。

1.6 觀察生存狀態 在進行實驗過程中密切觀察小鼠的呼吸情況、體力活動以及生命狀態。

1.7 混合淋巴細胞反應(MLR) 頸椎脫臼法處死小鼠，無菌條件下取出脾臟，制備脾臟單細胞懸液。裂解紅細胞，獲得同種異體脾臟細胞作為反應細胞。培養獲得的樹突細胞作為刺激細胞，用RPMI 1640培養液懸浮，調整密度為5×106cell/ml，加入終質量濃度為25 ng/ml的絲裂霉素C，37 ℃孵育45 min。PBS清洗后用RPMI 1640培養液重懸，分別以1.25×103/孔、2.50×103/孔、5.00×103/孔、10.00×104/孔96孔培養板，每組設3個復孔，每孔再加入1×105個同種異體T細胞，終體積為200 μl，設單純T細胞組為對照組，另設空白組。于37 ℃、5%CO2條件下培養72 h。各孔加入CCK-8 10 μl，置培養箱4 h，用酶標儀測A450值，取3孔的平均值作為結果，計算刺激指數(SI)，SI=(實驗組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)。

1.8 測定脾臟質量 取出小鼠脾臟，觀察脾臟大小，并用計量器準確稱量其質量。

1.9 肺泡灌洗液組胺水平檢測 霧化后24 h麻醉小鼠，暴露氣管，氣管插管并固定，結扎右側主支氣管，用1 ml注射器吸取0.3 ml PBS，接入氣管針，來回反復抽吸5次，收集灌洗液。重復灌洗兩次。每只小鼠共用0.9 ml PBS,回收灌洗液置于1只EP管中，混勻，-20 ℃保存備用。

1.10 肺組織蘇木素-伊紅(HE)染色 取右側未行肺泡灌洗的肺組織，置于甲醛固定液中固定24 h以上，脫水，石蠟包埋，切片后行HE染色，鏡下觀察并攝影。

2 結果

2.1 樹突細胞的形態 每只小鼠的股骨和脛骨共可分離(1.5～2.0)×107個骨髓細胞，培養2 d后，倒置顯微鏡下可見部分細胞貼壁生長，分布均勻，有細胞聚集現象，細胞大小比較一致，呈圓形。第3天時，可見大量細胞集落，緊密貼壁，極少數細胞從集落周邊脫落，細胞呈圓形，但可見少數棘突樣結構突出于細胞表面，細胞體積有所增大(見圖1A)。培養第4、5天，細胞集落繼續變大，細胞形態不規則，周邊棘突增多。第6、7天，細胞不斷從集落上脫落下來，細胞集落變小，多數細胞呈懸浮狀態，大小不均勻，形態亦不規則，周邊布滿指狀突起(見圖1B)。

注：A第3天大量細胞集落貼壁生長，細胞呈圓形，大小一致(×100)；B 第6天細胞集落呈懸浮狀態，表面可見指狀的細胞突起(×200)，右下角為樹突細胞表面情況，可見明顯的樹突狀結構(×400)

圖1 樹突細胞培養

Figure1 Culture of DCs

2.2 樹突細胞的免疫表型檢測 流式細胞術分析顯示，細胞中CD11c的陽性率大于80%，所獲得的樹突細胞的純度很好，可以用于體內回輸。對未經處理的樹突細胞、負載OVA的樹突細胞和LPS刺激后的樹突細胞分別檢測MHCⅡ和CD86表達情況，結果顯示未經處理的樹突細胞和負載OVA的樹突細胞表達MHCⅡ和CD86的陽性率低，且表達水平低；而LPS刺激后的樹突細胞兩種分子的陽性率增高，且表達水平提高(見圖2)。

2.3 樹突細胞刺激MLR檢測 CCK-8檢測MLR顯示，未經處理的樹突細胞和負載OVA的樹突細胞刺激淋巴細胞增殖能力一樣，僅在樹突細胞:淋巴細胞為1∶10時才能刺激淋巴細胞增殖，但LPS刺激后的樹突細胞卻能極大地促進淋巴細胞的增殖(見圖3)。

圖2 樹突細胞表面膜分子的表達

注：SI=刺激指數

圖3 混合淋巴細胞增殖試驗

Figure3 Mixed lymphocyte proliferation test

2.4 樹突細胞回輸后實驗小鼠的生存狀態 在實驗過程中，密切觀察小鼠的生存狀態。第1天,健康對照組、哮喘組、OVA-DC干預組小鼠未見任何異常。第7天腹腔注射OVA后，哮喘組和OVA-DC干預組小鼠行為稍顯遲緩，5～6 h后恢復正常。第14天腹腔注射OVA后，哮喘組小鼠行為遲緩，但對外界干擾有反應，6 h后恢復正常；OVA-DC干預組小鼠趴伏不動，對外界干擾無反應，且在2 h內可見大部分小鼠死亡，余下活鼠24 h后恢復正常。第27、28、29天連續霧化吸入1% OVA，霧化過程中可見哮喘組和OVA-DC干預組小鼠打噴嚏。

2.5 樹突細胞回輸后小鼠脾臟質量變化 第14天腹腔注射OVA后，解剖小鼠取出脾臟，3組小鼠脾臟質量比較，差異有統計學意義(P<0.05)，OVA-DC干預組較健康對照組和哮喘組升高，哮喘組較健康對照組升高，差異均有統計學意義(P<0.05，見圖4、表1)。

2.6 肺泡灌洗液組胺水平檢測 通過氣管插管收集肺泡灌洗液，回收率約為80%。ELISA法檢測結果顯示，3組肺泡灌洗液組胺水平比較，差異有統計學意義(F=613.00，P=0.000)，OVA-DC干預組較健康對照組和哮喘組升高，哮喘組較健康對照組升高，差異均有統計學意義(P<0.05，見圖5)。

表1 3組脾臟質量比較

注：與OVA-DC干預組比較，*P<0.05；與哮喘組比較，△P<0.05

圖4 各組小鼠脾臟大體形態

圖5 3組組胺水平比較

2.7 肺組織HE染色 HE染色顯示OVA-DC干預組小鼠肺組織氣道管壁增厚，周圍有大量炎性細胞浸潤；哮喘組小鼠炎性反應較輕；健康對照組小鼠未發現炎性反應的特征(見圖6)。

3 討論

樹突細胞作為機體最強大的抗原提呈細胞，可以攝取、加工和提呈抗原，激活初始T淋巴細胞，能介導強烈的免疫系統對異物進行識別和清除，是免疫系統的“衛士”[7]。此外，樹突細胞還可以介導免疫耐受，在免疫自穩、移植物耐受中發揮重要作用[8-11]。樹突細胞與過敏性疾病發生密切相關，參與過敏反應的始動環節[12]，因此，其在過敏性疾病中的研究應用已受到人們的關注。

過敏性哮喘的發病機制主要是Ⅰ型超敏反應，目前有越來越多的研究表明，過敏性哮喘患者體內樹突細胞在功能上存在一定異常，有偏向Th2反應的趨勢[4]。哮喘患者肺組織和外周血中樹突細胞的數目也明顯增加，且在過敏性哮喘患者急性發病期，其外周血CD86、MHCⅡ表達明顯增高[5]。這些研究均表明樹突細胞在過敏性哮喘的發病機制中發揮重要作用。

注：A為健康對照組，B為哮喘組，C為OVA-DC干預組

圖6 肺組織HE染色(×40)

Figure6 HE staining of lung tissues

本實驗誘導小鼠骨髓細胞分化為樹突細胞并負載OVA,流式細胞術檢測結果顯示負載OVA的樹突細胞和未處理的樹突細胞相比，MHCⅡ分子和CD86的表達量均處于低水平，且平均熒光強度很低，而用LPS刺激后的樹突細胞MHCⅡ分子和CD86的表達出現爆發式的升高，表明樹突細胞在負載OVA后仍處于未成熟狀態，該結果與吳衛疆等[13]報道的情況一致。MLR也表明負載OVA的樹突細胞仍處于未成熟狀態，其刺激淋巴細胞增殖的能力與未成熟樹突細胞相當，僅當樹突細胞與淋巴細胞的比例在1∶10時能微弱地刺激淋巴細胞增殖，而LPS刺激后的樹突細胞能強烈地刺激淋巴細胞增殖。尾靜脈注射負載OVA的樹突細胞后經過致敏和激發，肺組織HE染色顯示，OVA-DC干預組小鼠肺組織支氣管黏膜水腫、增厚，周圍有大量炎性細胞浸潤，其炎癥表現明顯強于哮喘組小鼠。肺泡灌洗液中的組胺水平與肺組織HE結果一致。此外，本研究還通過腹腔注射OVA-DC，其實驗結果與尾靜脈注射相同。這一發現與之前的報道完全相反，負載OVA的樹突細胞經腹腔注射給小鼠后可以在一定程度上抑制過敏性哮喘[12]。本實驗中，OVA-DC干預組小鼠在第二次給予腹腔注射OVA后，小鼠活動顯著減少，對外界干擾無反應，生命狀態極差，2 h內一半以上的小鼠死亡，尸檢發現脾臟極度增大，其體積是正常小鼠的3倍以上，也顯著大于哮喘組小鼠的脾臟，其余組織未發現異常。對于OVA-DC干預組小鼠的死亡，可能是因為強烈的免疫反應所致，但具體原因未能明確。本實驗結果進一步表明，將負載OVA的樹突細胞尾靜脈注射或腹腔注射給小鼠會加重小鼠的過敏性哮喘反應，并可能導致小鼠死亡。可能是因為負載OVA的樹突細胞在進入小鼠體內后進一步成熟，高表達MHCⅡ、CD86以及其他和抗原提呈相關的分子，然后激活T細胞發揮免疫反應。相關的文獻報道，過敏性哮喘患者外周血中樹突細胞高表達MHCⅡ、CD80、CD86等與抗原提呈相關的分子[5,14]。此外，哮喘小鼠模型肺組織中樹突細胞也高表達MHCⅡ和CD80等共刺激分子[15-17]。并且在有過敏原刺激時，血液中的樹突細胞可以被募集到肺組織[18-19]。這些發現都說明樹突細胞在過敏性哮喘中發揮重要作用。

本研究發現將負載抗原的樹突細胞回輸至小鼠體內可以誘導小鼠產生強烈的免疫反應，能加重過敏性哮喘反應的嚴重程度，并能引起小鼠死亡。表明樹突細胞在血液和肺組織中數量的增加和抗原提呈相關分子的高表達都能促進哮喘的發生。進一步說明樹突細胞在過敏性哮喘的發病機制中發揮重要作用，為哮喘的預防和治療提供新的理論依據。對于負載抗原的樹突細胞回輸至體內能增強機體的免疫反應這一作用，還可能為其他疾病，如感染性疾病、腫瘤等疾病的預防和治療提供新思路。

1 Murphy DM,O′Byme PM.Recent advances in the pathophysiology of asthma[J].Chest,2010,137(6):1417-1426.

2 Sousa RC,Sher A,Kaye P.The role of dendritic cells in the induction and regulation of immunity to microbial infection[J].Curr Opin Immunol,1999,11(4):392-399.

3 Lambrecht BN.The dendritic cell in allergic airway diseases:a new player to the game[J].Clin Exp Allergy,2001,31(2):206-218.

4 Hammad H,Charbonier AS,Duez C,et al.Th2 polarization by Der p 1——pulsed monocyte-derived dendritic cells is due to the allergic status of the donors[J].Blood,2001,98(4):1135-1141.

5 Spears M,McSharry C,Donnelly I,et al.Peripheral blood dendritic cell subtypes are significantly elevated in subjects with asthma[J].Clin Exp Allergy,2011,41(5):665-672.

6 Inaba K,Inaba M,Romani N.Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor[J].J Exp Med,1992,176(6):1693-1702.

7 Steinman RM.Decisions about dendritic cells:past,prisent,and future[J].Annual Review of Immunology,2011,30:1-22.

8 Steinman RM.Dendriticcells:understanding immunogenicity[J].European Journal of Immunology,2007,37(1):53-60.

9 Xin H,Yang W,Wang Q,et al.Immune tolerance of skin allograft transplantation induced by immature dendritic cells of a third party carrying donor antigens in mice[J].Transplantation Proceedings,2013,45(2):552-557.

10 Sela U,Olds P,Park A,et al.Dendritic cells induce antigen-specific regulatory T cells that prevent graft versus host disease and persist in mice[J].The Journal of Experimental Medicine,2011,208(12):2489-2496.

11 Steinman RM,Hawiger D，Nussenzweig MC.Tolerogenic dendritic cells[J].Annual Review of Immunology,2003,21:685-711.

12 Galli SJ,Tsai M,Piliponsky AM.The development of allergic inflammation[J].Nature,2008,454(7203):445-454.

13 吳衛疆，珪建，夏大靜,等.耐受性樹突狀細胞對哮喘小鼠氣道變應性炎癥反應的抑制作用[J].江蘇大學學報:醫學版，2007,17(4)：285-289.

14 黃建安，張臘娣，於葛華，等.共刺激分子B7-CD28/CD152在過敏性哮喘中的作用[J].江蘇醫藥雜志，2003,29(11)：806-807.

15 李俊，楊炯，郭衛，等.過敏性哮喘患者樹突狀細胞接觸變應原前后的表型變化[J].中國臨床康復，2006,10(4)：85-88.

16 王耀麗，錢桂生，程曉明.肺臟樹突狀細胞表面共刺激分子在小鼠哮喘模型中的表達[J].免疫學雜志，2006,23(2):195-198.

17 劉煥星，曹平.調節性樹突狀細胞對哮喘小鼠氣道炎癥及白介素12和IgE表達的影響[J].中國全科醫學，2012，15(6)：2063.

18 Vassalo R.The pulmonary dendritic/langerhans cell immunity and disease[J].Clin Pulm Med,2005,12(2):84-89.

19 Master BJ.Initiation of lung immmunity：the afferent limb and the role of dendritic cells[J].Semin Respir Crit Care Med,2004,25(1):11-20.