通心絡膠囊對糖尿病視網膜病變KK/Upj-Ay小鼠血液及視網膜炎性因子表達的影響

王 超，邢邯英，王 杏，劉 敏，張 哲

糖尿病視網膜病變(DR)是臨床2型糖尿病患者常見的微血管病變并發癥之一，是一種具有特異性改變的眼底病變，其發病率呈逐年上升趨勢[1]。DR發生的確切機制仍未明確，有研究表明持續性高血糖、氧化應激、炎性反應、細胞凋亡、血-視網膜屏障受損等因素均會引起DR的病理生理變化；大量文獻報道了炎癥在DR生成中占有重要地位，隨后的研究也確定了DR是一種“炎癥疾病”[2]。腫瘤壞死因子α(TNF-α)、細胞間黏附分子1(ICAM-1)、白介素6(IL-6)、白介素1β(IL-1β)等多種炎性因子含量在 DR患者玻璃體、房水、血清中增加，它們之間的相互作用影響了DR疾病的發生發展。本實驗采用自發性2型糖尿病KK/Upj-Ay小鼠作為DR小鼠模型，觀察通心絡膠囊對KK/Upj-Ay小鼠血清及視網膜炎性因子表達的影響，為臨床治療糖尿病微血管病變提供新的用藥選擇。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 自發性2型糖尿病KK/Upj-Ay小鼠40只，12周齡，雄性，30～40 g；C57BL/6小鼠10只，12周齡，雄性，25～30 g。均購于北京華阜康生物科技股份有限公司，生產許可證號：SCXK-(京)2009-0002。

1.1.2 藥物、試劑與儀器 通心絡膠囊購于石家莊以嶺藥業股份有限公司。TNF-α、ICAM-1、IL-6、IL-1β引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。TNF-α、ICAM-1、IL-6、IL-1β一抗購于Abcam公司。7300 Real-Time PCR System儀購于ABI公司；Biorad凝膠成像分析儀購于Biorad公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠分組 按KK/Upj-Ay小鼠空腹血糖(FBG)水平從低到高排列，然后按照隨機數字表法，將小鼠分為模型組、通心絡低劑組、通心絡中劑組、通心絡高劑組，保證各組小鼠平均FBG水平間無差異；另設C57BL/6小鼠為對照組，每組10只小鼠。各組小鼠灌胃給藥，通心絡低劑組、通心絡中劑組、通心絡高劑組小鼠分別給予1、2、4 g生藥/kg的通心絡膠囊，對照組和模型組小鼠灌胃等體積的蒸餾水，1次/d。各組小鼠自由飲食飲水，連續12周。

1.2.2 體質量及FBG測定 每月記錄1次小鼠體質量。實驗結束后從小鼠眼球取血，測定FBG水平。

1.2.3 血-視網膜屏障功能測定 給藥結束，每組取6只小鼠，尾靜脈注射50 mg/kg伊文思藍(EB)溶液。2 h后麻醉小鼠，灌注4%多聚甲醛緩沖液，灌注壓力為80 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)。灌注4 min后摘除眼球，分離視網膜，稱量。將視網膜放入150 μl甲酰胺溶液，37 ℃孵育12 h，3 000 r/min 離心(離心半徑13.5 cm)10 min，取上清液置96孔酶標板，620 nm處測定光密度(OD)。通過比色法測定EB的含量(單位為ng/mg)，從而反映血-視網膜屏障功能。

1.2.4 視網膜形態學觀察 實驗結束，快速取小鼠眼球，用甲醛固定，脫水切片，HE染色，光鏡下觀察形態學。

1.2.5 流式細胞儀檢測小鼠全血中炎性因子水平 每組取3只小鼠全血，分離外周血單個核細胞，加入(12-)十四酸佛波酯(-13-)乙酸鹽(PMA)和離子霉素刺激淋巴細胞，應用流式細胞儀檢測細胞，Exp32軟件獲取分析細胞。每個檢測獲取10 000個細胞，分析TNF-α、ICAM-1、IL-6、IL-1β的表達。

1.2.6 Real time PCR測定小鼠視網膜炎性因子mRNA的表達 取小鼠視網膜，常規方法提取組織RNA，鑒定，按試劑盒說明書進行Real Time PCR擴增，以GAPDH作為內參照。TNF-α引物：上游5′- CCACCACGCTCTTCTGTCTA -3′，下游5′-GGCAGCCTTGTCCCTTGAA-3′，產物片段315 bp；IL-6引物：上游5′-GTTGCCTTCTTGGGACTGATG-3′，下游5′- CCTTAGCCACTCCTTCTGTGAC -3′，產物片段525 bp；ICAM-1引物：上游5′- TTCCGCTACCATCACCGTGT -3′，下游5′-AGGTCCTTGCCTACTTGCTG -3′，產物片段84 bp；IL-1β引物：上游5′-AGCCCATCCTCTGTGACTCA-3′，下游5′- TTTGTTGTTCATCTCGGAGCC-3′，產物片段99 bp；GAPDH引物：上游5′-TGCTGAGTATGTCGTGGAGTC-3′，下游5′-TGCTGAGTATGTCG TGGAGTC-3′，產物片段143 bp。用儀器自帶軟件分析，將對照組設置為1，與對照組進行比較后的相對定量值為目的基因表達。

1.2.7 蛋白質印跡法(Western blotting)檢測小鼠視網膜炎性因子蛋白的表達 每組取3只小鼠的視網膜，加裂解液提取視網膜組織蛋白，加入稀釋合適濃度的TNF-α、ICAM-1、IL-6、IL-1β抗體，化學發光法顯色。以β-actin作為內參，掃描后對條帶進行吸光度積分分析，以目的蛋白吸光度值/β-actin吸光度值的比值為目的蛋白表達。

2 結果

2.1 各組小鼠體質量及FBG的變化 給藥前，模型組及通心絡各劑量組小鼠體質量及FBG水平均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)；給藥后12周，模型組及通心絡各劑量組小鼠體質量及FBG水平仍高于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)；雖然給藥后12周，通心絡各劑量組小鼠體質量及FBG水平較模型組有下降的趨勢，但組間比較差異無統計學意義(P>0.05，見表1)。

2.2 各組小鼠給藥后12周視網膜EB含量比較 給藥后12周，各組小鼠視網膜EB含量比較，差異有統計學意義(P<0.01)；其中模型組及通心絡低劑組小鼠視網膜EB含量高于對照組，通心絡中、高劑組小鼠視網膜EB含量低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05，見表2)。

Table1 Comparison of the body weights and FBG levels among various groups of mice before treatment and 12 weeks after treatment

組別只數體質量(g) 給藥前 給藥后12周FBG(mmol/L) 給藥前 給藥后12周對照組10252±10305±2853±0855±09模型組10344±20?460±22?148±27?175±28?通心絡低劑組10350±20?444±34?147±28?165±24?通心絡中劑組10348±30?443±20?146±26?158±19?通心絡高劑組10349±19?434±38?149±23?150±23?F值4346489132455160P值000000000000

注：FBG=空腹血糖；與對照組比較，*P<0.01

Table2 Comparison of EB content in retina among various of groups of mice 12 weeks after treatment

組別只數EB對照組6126±26模型組6255±36△通心絡低劑組6208±39?通心絡中劑組6164±26▲通心絡高劑組6161±24▲F值1567P值000

注：EB=伊文思藍；與對照組比較，*P<0.05，△P<0.01；與模型組比較，▲P<0.01

2.3 各組小鼠給藥后12周視網膜形態學變化 給藥后12周，光鏡下觀察到對照組小鼠視網膜色素上皮層，視錐、視桿細胞層，外界膜，外顆粒層等各層細胞層次分明，排列整齊，結構緊密；模型組小鼠視網膜各層細胞排列紊亂，色素上皮層細胞明顯變薄；而通心絡各劑量組小鼠視網膜各層細胞排列較清晰(見圖1)。

2.4 各組小鼠給藥后12周血液中炎性因子水平比較 給藥后12周，各組小鼠血液中TNF-α、ICAM-1、IL-6、IL-1β水平比較，差異有統計學意義(P<0.01)；其中模型組及通心絡各劑量組小鼠TNF-α、ICAM-1、IL-6、IL-1β水平高于對照組，通心絡中、高劑組小鼠TNF-α、ICAM-1、IL-1β水平低于模型組，通心絡各劑量組小鼠IL-6水平低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05，見表3)。

Table3 Comparison of blood levels of TNF-α，ICAM-1，IL-6 and IL-1β among various groups of mice 12 weeks after treatment

組別只數TNF-αICAM-1IL-6IL-1β對照組3363±067033±006210±040137±029模型組31893±355△750±110△643±060△1050±235△通心絡低劑組31443±190△697±071△403±086?☆883±171△通心絡中劑組3960±130△☆420±080△☆390±061?☆513±081△☆通心絡高劑組3720±176?★320±066△★380±040?★393±070△☆F值2534460319972118P值000000000000

注：TNF-α=腫瘤壞死因子α，ICAM-1=細胞間黏附分子1，IL-6=白介素6，IL-1β=白介素1β；與對照組比較，*P<0.05，△P<0.01；與模型組比較，☆P<0.05，★P<0.01

2.5 各組小鼠給藥12周后視網膜TNF-α、ICAM-1、IL-6、IL-1β mRNA及蛋白表達水平比較 給藥后12周，各組小鼠視網膜TNF-α、ICAM-1、IL-6、IL-1β mRNA及蛋白表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.01)；其中模型組小鼠視網膜TNF-α、ICAM-1、IL-6、IL-1β mRNA及蛋白表達水平高于對照組，通心絡各劑量組小鼠視網膜TNF-α、ICAM-1、IL-6、IL-1β mRNA及蛋白表達水平均低于模型組，差異有統計學意義(P<0.01，見表4、圖2、圖3)。

3 討論

通心絡膠囊是以人參、水蛭、全蝎、赤芍、蟬蛻等組方的中藥復方制劑，具有益氣活血、通絡止痛功能。文獻報道通心絡具有改善血液流變學、血管內皮功能、微循環的功能，對臨床DR患者有治療作用[3]，但其具體機制尚不明確。DR發病機制復雜，包括持續性高血糖、氧化應激、炎性反應、細胞凋亡等[4]。本研究采用了自發性2型糖尿病KK/Upj-Ay小鼠作為DR小鼠模型[5]，觀察到通心絡膠囊灌胃12周能明顯改善KK/Upj-Ay小鼠視網膜形態學，視網膜各層細胞層次較清楚，小鼠血-視網膜屏障功能得到明顯改善，表明通心絡膠囊對治療DR有一定的作用。但本研究觀察到通心絡膠囊并未明顯降低小鼠體質量和FBG，故推測降糖不是通心絡膠囊治療DR的主要機制。

炎性反應在DR發生發展中占有重要地位[6]。朱丹等[3]認為DR是一種“炎性疾病”。主要的炎性因子有TNF-α、ICAM-1、IL-1、單核細胞黏附因子1(MCP-1)等[7]。DR中的炎性因子包括全身因子和局部因子。臨床研究顯示DR患者血清中全身炎性因子IL-1β、TNF-α、血管內皮生長因子(VEGF)濃聚，與 DR的發生和嚴重性密切相關[8]。本研究中，流式細胞術結果顯示DR小鼠血清TNF-α、ICAM-1、IL-6、IL-1β水平較對照組小鼠升高，表明全身炎性因子可能共同作用于DR的發展。給予通心絡膠囊灌胃治療12周，小鼠血清TNF-α、ICAM-1、IL-6、IL-1β水平較模型組小鼠降低，提示通心絡膠囊有抑制DR小鼠全身炎性因子的作用。

注：1為對照組，2為模型組，3為通心絡低劑組，4為通心絡中劑組，5為通心絡高劑組

圖1 各組小鼠視網膜形態學變化(HE染色，×200)

注：與對照組比較，*P<0.05，△P<0.01；與模型組比較，★P<0.01

注：TNF-α=腫瘤壞死因子α，ICAM-1=細胞間黏附分子1，IL-6=白介素6，IL-1β=白介素1β

圖2 各組小鼠視網膜炎性因子mRNA表達水平的熒光定量PCR擴增曲線

Figure2 Amplification curve of real-time fluorescent quantitative PCR for retina inflammatory cytokines mRNA expression level of various groups of mice

注：1為對照組，2為模型組，3為通心絡低劑組，4為通心絡中劑組，5為通心絡高劑組

圖3 各組小鼠視網膜炎性因子表達水平的Western blotting結果

Figure3 Results of Western blotting of retina inflammatory cytokines expression level of various groups of mice

Suzuki等[9]研究發現DR玻璃體中炎性因子IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、MCP-1、血小板衍生因子(PDGF)、VEGF水平增高。玻璃體內IL-6、VEGF、ICAM-1與糖尿病黃斑水腫的嚴重程度呈正相關。在DR小鼠視網膜中，本研究也觀察到了炎性因子TNF-α、ICAM-1、IL-6、IL-1β mRAN及蛋白表達水平升高，提示炎癥在DR小鼠中的重要作用；同時觀察到通心絡膠囊能降低視網膜中TNF-α、ICAM-1、IL-6、IL-1β mRNA及蛋白表達水平，提示通心絡膠囊不僅能降低全身炎性因子水平，還能抑制視網膜局部炎性因子的表達，最終達到抑制炎癥治療DR的作用。通心絡膠囊十二味中藥組方中，人參、水蛭和赤芍現代藥理研究表明均具有顯著的抗炎作用，因此本研究推測通心絡膠囊抑制DR小鼠炎性因子表達與此有關，但其具體抗炎成分尚需進一步研究。另外，在本研究中，1～4 g生藥/kg通心絡膠囊量效關系有一定的趨勢，但無差異。在通常研究中，化藥有很明確的量效關系，但中藥不同，很難有特別明確的劑量關系，也許是中藥本身的特性。

目前，炎性遞質已經成為了治療視網膜損傷的治療靶點，如VEGF阻滯劑[10]、血管緊張素2(Ang-2)抑制劑、TNF-α抑制劑等。通心絡膠囊在臨床應用多年，具有不良反應小的中藥傳統優勢，對其進行深入研究將為臨床治療DR提供新的用藥思路。

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10 Montero JA，Ruiz-Moreno JM，Correa ME.Intravitreal anti-VEGF drugs as adjuvant therapy in diabetic retinopathy surgery[J].Curr Diabetes Rev，2011，7(3)：176-184.

本文鏈接——

1 KK/Upj-Ay小鼠是一種毛色基因(Ay)突變的2型糖尿病動物模型，Ay基因不僅影響小鼠的毛色，還可引起代謝紊亂，也可出現高飲食、肥胖、高血糖、脂質代謝紊亂和高胰島素血癥，因此要比同周齡的C57BL/6正常小鼠體質量大很多。

2 自發性2型糖尿病KK/Upj-Ay小鼠用于糖尿病視網膜病變研究已有多篇文獻報道，如本文參考文獻[5]。另外，光鏡下也觀察到了KK/Upj-Ay小鼠視網膜形態學變化(見圖1)，故本研究以KK/Upj-Ay小鼠作為糖尿病視網膜病變模型。

3 本研究根據小鼠空腹血糖(FBG)分組，就是將所有的小鼠測定FBG，然后按照FBG水平從低到高排列，水平相近的4只小鼠配成1個區組。再根據隨機數字表法，每個小鼠對應一個隨機數字，在每個區組內將隨機數字按大小排序，序號為1的為模型組，序號為2的為通心絡低劑組，序號為3的為通心絡中劑組，序號為4的為通心絡高劑組，這樣保證模型組及通心絡低、中、高劑組小鼠平均FBG水平間有均衡性。