腫瘤壞死因子α增強主動脈環收縮在感染性休克中的機制研究

周 瑩，劉 沛

感染性休克是由病原微生物及其毒素或抗原-抗體復合物引起的以急性微循環障礙為主要表現的一組臨床綜合征。主要血流動力學改變包括低血壓、低外周血管阻力、血管對收縮劑反應性下降、血流重新分布等[1]，是由腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)、白介素1(IL-1)、血小板活化因子(PAF)、花生四烯酸代謝產物〔前列環素(PG)、白三烯(LT3)、血栓素A2(TXA2)〕、一氧化氮(NO)等多種因子共同作用的結果[2]。多項動物實驗證實，TNF-α是引起感染性休克、多器官功能衰竭(MOF)的主要遞質[3]。有證據表明TNF-α可通過多種途徑間接參與心肌細胞、血管平滑肌細胞(VSMC)和支氣管平滑肌細胞的收縮[4]。感染性休克中血流動力學的改變與血管的收縮、舒張能力變化有關，為了探討TNF-α在感染性休克血管收縮性變化中的作用，本實驗試圖在器官及細胞水平上應用TNF-α預處理離體去內皮主動脈環，觀察其在血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)作用下的收縮反應，并分離培養VSMC，經TNF-α預處理后觀察細胞內游離鈣離子濃度([Ca2+]i)的變化，探討TNF-α影響VSMC功能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性Wistar大鼠60只(中國醫科大學實驗動物中心)，體質量200～250 g；乙酰甲酯(Fluo-3/AM)、AngⅡ、乙酰膽堿(Sigma公司)；TNF-α(R&D公司)；2-氨基乙氧基聯苯硼酸鹽(2-APB，Merck公司)；兔抗α-肌動蛋白單克隆抗體、TRITC標記山羊抗兔IgG抗體(北京中山生物技術有限公司)；DMEM培養液、標準胎牛血清(Gibco公司)；25 cm2培養瓶、3.5 cm薄底平皿(Corning公司)；乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)、TritonX-100、氯化鈣(CaCl2)等化學試劑(中國醫藥集團上海化學試劑公司)。

張力傳導放大器(TB-611T，Nihon Kohden公司)；激光共聚焦顯微鏡及LSM510軟件(德國Carl Zeiss公司)。實驗時間為2012年3—6月，地點為中國醫科大學中心實驗室。

1.2 方法

1.2.1 離體主動脈環制備及反應性測定

1.2.1.1 離體主動脈環制備 選取24只Wistar大鼠，采用45%烏拉坦和5%氯醛糖混合液1 ml腹腔注射使大鼠致死，開胸取胸主動脈置于通有95%氧氣(O2)和5%二氧化碳(CO2)的Kreb液中，分離周圍的脂肪和結締組織后剪成數個長3～5 mm的主動脈環，用內皮摩擦法去除內皮。將制備好的主動脈環垂直懸掛于裝有Kreb液的浴槽中(pH 7.4，以95%O2和5%CO2的混合氣持續通氣)，基礎張力1.2 g平衡45 min(每隔15 min換液)，給予40 mmol/L氯化鉀(KCl)使主動脈環收縮，收縮幅度>0.6 g。在收縮頂峰時給予10-6mol/L乙酰膽堿(檢驗有無內皮，如舒張幅度大于30%認為內皮完整，如無舒張則為去內皮)，無舒張的標本留用。留用標本沖洗后重復給予40 mmol/L KCl直至前后連續2次得到的收縮幅度之差小于0.1 g的標本進行下一步實驗。

1.2.1.2 實驗分組和給藥 留用的主動脈環在給予KCl后每隔15 min換液1次，平衡30 min后隨機分為4組：去內皮對照組(浴槽液為Kreb液)、去內皮TNF-α組(浴槽液為含5 μg/L TNF-α的Kreb液)、去內皮無鈣對照組(浴槽液為無鈣的Kreb液)和去內皮無鈣TNF-α組(浴槽液為含5 μg /L TNF-α的無鈣的Kreb液)，每組6只。各組主動脈環在孵育1 h后給予10-7mol/L(終濃度)AngⅡ，記錄收縮幅度。

1.2.2 原代培養VSMC及其內[Ca2+]i測定

1.2.2.1 改進的原代VSMC培養及鑒定 參照Chamley-Campbell等[5]歸納的VSMC培養方法。無菌取出3只Wistar大鼠胸主動脈，用0.9%氯化鈉注射液沖洗5遍。剝去外膜，縱向剖開血管。用0.25%胰蛋白酶室溫消化內膜2～3 min，加入2～3 ml含20%胎牛血清的DMEM終止消化。然后刮去內膜，將留下的中膜切成1 mm2大小的組織碎塊，間隔0.5 cm置于培養瓶內，置37 ℃ 5%CO2孵箱中2～4 h，加入5 ml含20%胎牛血清的DMEM培養。3～7 d可見組織塊邊緣出現新生細胞，細胞生長融合后傳代。在光鏡下進行形態鑒定，用抗α-肌動蛋白抗體熒光染色鑒定細胞及純度。

1.2.2.2 VSMC的準備及分組 把生長穩定的第4～12代VSMC隨機分為對照組(正常細胞30個)、TNF-α組(加入TNF-α后孵育8 h的細胞27個)；另設上述2組于加AngⅡ前10 min加入2-APB，即2-APB拮抗對照組和2-APB拮抗TNF-α組，各30個細胞。預實驗2-APB濃度為20、40、80、100 μmol/L，本實驗采用具有完全阻斷效應的最低濃度40 μmol/L。

1.2.2.3 VSMC內[Ca2+]i測定[6]培養液中加入Fluo-3/AM(終濃度為5 μmol/L)，37 ℃CO2培養箱中避光負載45 min，Hank′s液洗去細胞外液中殘余的Fluo-3/AM，加無鈣D-Hank′s緩沖液1 ml后，采用confocal顯微鏡測定單個活細胞內Ca2+熒光強度(發射波長505 nm，激發波長488 nm)。測定基礎值(靜息時)后，依次加入AngⅡ(終濃度10-7mol/L)、CaCl2(原液為1 mol/L，加入D-Hank′s至過量)、TritonX-100(終濃度1%)、EGTA(終濃度10 μmol/L)。動態觀察細胞內Ca2+釋放引起的鈣熒光強度(FI)的變化。采用LSM510軟件對數據、圖形進行實時動態測量與分析，根據給藥(AngⅡ)前后單個細胞的FI值計算出細胞內[Ca2+]i，公式如下：[Ca2+]i(nmol/L)=kd×(F-Fmin)/(Fman-F)。kd 為Fluo-3/AM與Ca2+結合反應的解離參數，室溫下kd=320 nmol/L；F為實際測得的FI值；Fmin為加入EGTA將細胞內Ca2+全部螯合，使細胞內無Ca2+時的FI值；Fmax為加入CaCl2、TritonX-100細胞內Ca2+飽和時的FI值。

2 結果

2.1 TNF-α對主動脈環收縮功能的影響 有鈣條件下，去內皮TNF-α組給予AngⅡ后主動脈環的收縮幅度高于去內皮對照組；無鈣條件下，去內皮無鈣TNF-α組給予AngⅡ后主動脈環的收縮幅度亦高于去內皮無鈣對照組，差異均有統計學意義(P<0.05，見表1)。

2.2 VSMC鑒定 VSMC細胞呈長梭形，胞質多有突起，核呈圓形、卵圓形。細胞可出現重疊生長現象，光鏡下觀察呈峰谷樣生長；免疫熒光抗α-肌動蛋白抗體染色陽性，沿細胞長軸與肌絲相同呈絲狀排列，陽性細胞占總細胞數的95%以上，表明所獲細胞為VSMC，純度可達95%以上，電鏡下可見細胞內束狀肌絲結構(見圖1)。

表1 有鈣條件和無鈣條件下各組主動脈環對AngⅡ的反應性

Table1 In Ca2+-present and Ca2+-free Kreb buffer，the reactiveness of aorta ring induced by AngⅡ in different groups

組別只數主動脈環對AngⅡ的反應性平均值(x±s)有鈣條件下 去內皮對照組6014015044021024028024±011 去內皮TNF-α組6030025045069087060053±024?無鈣條件下 去內皮無鈣對照組6015000015002004021010±008 去內皮無鈣TNF-α組6021014023014015024019±005△

注：與去內皮對照組比較，*t=-2.645，P=0.025；與去內皮無鈣對照組比較，△t=-2.35，P=0.047

注：A為新生VSMC(×200)，B為傳代VSMC(×400)，C為α-肌動蛋白抗體熒光染色(×100)，D為光鏡下細胞內的肌絲結構(×10 000)

圖1 VSMC細胞鑒定結果

Figure1 Identification result of VSMC

2.3 VSMC內[Ca2+]i測定 4組VSMC靜息狀態下[Ca2+]i無自主上升，在無鈣緩沖液中，靜息狀態下4組VSMC內[Ca2+]i間差異無統計學意義(P>0.05)。加入AngⅡ后，4組[Ca2+]i升高值間差異有統計學意義(P<0.05)；其中TNF-α組VSMC內[Ca2+]i均高于其他3組，差異有統計學意義(P<0.05)；而2-APB拮抗對照組、2-APB拮抗TNF-α組VSMC內[Ca2+]i間差異無統計學意義(P>0.05，見表2)。測鈣圖見圖2。

3 討論

許多學者認為在感染性休克時由感染促發的全身炎性反應為介導的二次打擊對器官的損害比原發感染作用更大，常造成血流動力學的紊亂和器官功能衰竭。TNF-α被公認為是引起感染性休克、MOF的主要遞質。Hollenberg等[7]應用主動脈環實驗證實大劑量TNF-α(1 000 U/ml)不僅作用于血管內皮，也可直接作用于血管平滑肌，導致血管舒張，對收縮劑反應性下降，但其所采用的TNF-α劑量明顯高于臨床報道范圍(200～800 mg/ml，相當于10～40 U/ml)，而Murphey等[8]在注射脂多糖(LPS)前給豬注射小劑量TNF-α(500 ng/kg)，發現可以降低死亡率并減輕低血壓的程度，提示小劑量TNF-α具有保護作用。說明TNF-α作為一種多效性的細胞因子，其效應有害或有利于機體主要取決于產生的數量、組織特異性定位、局部TNF-α結合蛋白的活性及細胞因子的環境等[9]。有報道指出，在失血性休克時，VSMC內[Ca2+]i的調節能力紊亂可能是造成休克的原因[10]；一些治療休克的藥物作用靶點也是調節VSMC內[Ca2+]i[11]。本實驗應用的去內皮主動脈環的反應性變化代表了VSMC的舒縮狀態，VSMC的收縮受AngⅡ等多種血管活性物質調節，后者與細胞膜上相應受體結合，激活磷脂酶C的β亞型，催化質膜磷脂酰肌醇二磷酸水解，生成三磷酸肌醇(IP3)和甘油二酯。IP3與1，4，5-三磷酸肌醇受體(IP3Rs)結合促進內質網儲備Ca2+釋放引起細胞收縮。細胞內[Ca2+]i變化能反映VSMC的功能狀態，因此監測細胞內[Ca2+]i變化能反映細胞的舒縮狀態。而Fluo-3/AM是常用的鈣熒光指示劑，其與細胞內游離鈣呈高度特異性結合，其FI值與[Ca2+]i呈正比。細胞內Ca2+來源于細胞外Ca2+內流和胞內鈣庫的鈣釋放[12]。而IP3Rs及RYR受體是主要的細胞內儲備Ca2+釋放通道，在VSMC內主要受IP3Rs調控，這一點可被2-APB阻斷Ca2+釋放實驗來證明。

注：A為對照組，B為TNF-α組，C為2-APB拮抗TNF-α組

圖2 各組VSMC在AngⅡ刺激下細胞內FI的時間變化曲線

Figure2 AngⅡ-induced VSMC intracellular calcium fluorescence intensity(FI)-time curves in different groups

表2 AngⅡ刺激下4組VSMC內[Ca2+]i比較

注：與TNF-α組比較，*P<0.001

本實驗結果顯示：(1)與對照組比較，在有鈣條件下加入5 g/L TNF-α能使去內皮主動脈環對AngⅡ的反應性升高；在無鈣條件下加入5 g/L TNF-α仍能使去內皮主動脈環對AngⅡ的反應性升高，提示主動脈環對AngⅡ的反應性升高與細胞內鈣釋放有關。(2)對照組、TNF-α組、2-APB拮抗對照組和2-APB拮抗TNF-α組VSMC靜息狀態下[Ca2+]i間無差異，而加入AngⅡ后，對照組和TNF-α組VSMC在短時間內(約20 s)FI迅速增加(即峰值升高相)，TNF-α組[Ca2+]i升高值顯著高于對照組，說明TNF-α能促進VSMC內儲備鈣釋放，與Song等[13]在實驗中發現感染性休克大鼠VSMC內[Ca2+]i明顯增加的結果一致。由于胞外液無鈣，胞內鈣儲庫排空后得不到再充盈，FI并未出現緩慢持久升高；當向細胞外液加入過量的CaCl2時兩組細胞均出現鈣飽和狀態且Fmax一致，提示兩組細胞的Fluo-3/AM負載水平及活性無差異。在加入2-APB后，2-APB拮抗對照組和2-APB拮抗TNF-α組VSMC此效應均可被40 μmol/L的2-APB完全阻斷，表現為對AngⅡ刺激無反應，[Ca2+]i升高值無差異。故TNF-α 間接影響細胞內[Ca2+]i是通過IP3Rs通路起作用的。

總之，TNF-α通過IP3Rs通路增強VSMC內鈣釋放，能夠使主動脈環對縮血管物質的反應性增強，這條信號通路與TNF-α促進核因子-κB受體活化因子配體-RANKL誘導小鼠骨髓巨噬細胞破骨細胞形成與分化的信號通路以及TNF-α調節神經元突觸內鈣信號的通路是一致的[14-15]，這也許是感染性休克早期機體維持血壓穩定的機制之一。進一步推測TNF-α在休克早期促進細胞內儲備鈣大量釋放使細胞內鈣耗竭，可能是導致休克晚期血管收縮性下降難以維持血壓的原因之一，進一步明確這一信號通路及其下游調控機制是未來的研究方向。

1 馮剛，蔣健，史以玨，等.內毒素休克時低血壓發病機制的探討[J].中國危重急救雜志，1999，11(8)：494-495.

2 Fahey TJ 3rd，Yoshioka T，Shires GT，et al.The role of tumor necrosis factor and nitric oxide in the acute cardiovascular response to endotoxin[J].Ann Surg，1996，223(1)：63-69.

3 Hu J，Wang Y，Wei X，et al.Synthesis and biological evaluation of novel thiazolidinone derivatives as potential anti-inflammatory agents[J].Eur J Med Chem，2013，64：292-301.

4 Suski M，Gebska A，Olszanecki R，et al.Influence of atorvastatin on angiotensin I metabolism in resting and TNF-α-activated rat vascular smooth musclecells[J].J Renin Angiotensin Aldosterone Syst，2013.[Epub ahead of print].

5 Chamley-Campbell J，Campbell GR，Ross R.The smooth muscle cell in culture[J].Physiol Rev，1979，59(1)：1-61.

6 Kekenes-Huskey PM，Cheng Y，Hake JE，et al.Modeling effects of L-type ca(2+) current and na(+)-ca(2+) exchanger on ca(2+) trigger flux in rabbit myocytes with realistic T-tubule geometries[J].Front Physiol，2012，3：351.

7 Hollenberg SM，Cunnion RE，Parrillo JE.The effect of tumor necrosis factor on vascular smooth muscle.In vitro studies using rat aortic rings[J].Chest，1991，100(4)：1133-1137.

8 Murphey ED，Traber DL.Pretreatment with tumor necrosis factor-alpha attenuates arterial hypotension and mortality induced by endotoxin in pigs[J].Crit Care Med，2000，28(6)：2015-2021.

9 Guo Z，Wang S，Jiao Q，et al.Soluble TNFR II/IgG1 Fc fusion protein treatment in the LPS-mediated septic shock of rats[J].Biomed Pharmacother，2009，63(7)：537-542.

10 Kai L，Wang ZF，Shi YL，et al.Opioid receptor antagonists increase [Ca2+]i in rat arterial smooth muscle cells in hemorrhagic shock [J].Acta Pharmacol Sin，2004，25(3)：395-400.

11 Zhao KS，Jin C，Huang X，et al.The mechanism of Polydatin in shock treatment[J].Clin Hemorheol Microcirc，2003，29(3/4)：211-217.

12 Rivera L，Brading AF.The role of Ca2+influx and intracellular Ca2+release in the muscarinic-mediated contraction of mammalian urinary bladder smooth muscle[J].BJU Int，2006，98(4)：868-875.

13 Song SK，Karl IE，Ackerman JJ，et al.Increased intracellular Ca2+：a critical link in the pathophysiology of sepsis?[J].Proc Natl Acad Sci U S A，1993，90(9)：3933-3937.

14 Xia L，Zhang D，Wang C，et al.PC-PLC is involved in osteoclastogenesis induced by TNF-α through upregulating IP3R1 expression[J].FEBS Lett，2012，586(19)：3341-3348.

15 Park KM，Yule DI，Bowers WJ.Tumor necrosis factor-alpha potentiates intraneuronal Ca2+signaling via regulation of the inositol 1，4，5-trisphosphate receptor[J].J Biol Chem，2008，283(48)：33069-33079.