益母草中生物堿的提取、分離、鑒定實(shí)驗(yàn)

彭湘君， 李尚春， 李銀保， 葉海艷， 余 磊

(1. 贛南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院, 江西 贛州 341000; 2. 株洲市第十三中學(xué), 湖南 株洲 412000)

0 引 言

益母草為唇形科植物益母草的干燥地上部分，是常用中藥，性味苦、辛、微寒，歸心、肝、膀胱經(jīng)，具有活血祛瘀、調(diào)經(jīng)、收縮子宮、利尿消腫之功效，主要用于治療月經(jīng)不調(diào)、胎漏難產(chǎn)、行經(jīng)腹痛及產(chǎn)后瘀阻等癥，被歷代醫(yī)家譽(yù)為“血家圣藥”，“經(jīng)產(chǎn)良藥”，為治療婦科疾病之要藥。《本草綱目》云：“益母草行經(jīng)養(yǎng)血，行血而不傷新血，養(yǎng)血而不滯瘀血，誠為血家之圣藥也。”活性成分主要有總生物堿，包括益母草堿和水蘇堿等，具有活血調(diào)經(jīng)、利尿消腫、抗炎鎮(zhèn)痛等多種生理活性[1-4]。此外，有研究表明，益母草生物堿能改善大鼠急性心肌梗死后的心功能，具有對抗垂體后葉素急性心肌缺血損傷的作用[5]。近年來，研究益母草中生物堿的提取[2,6]、分離[7-8]、含量測定[9]、鑒定[10-11]的文獻(xiàn)越來越多，也有少量研究益母草黃酮類物質(zhì)的文獻(xiàn)[12]。本文在綜合各文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，研究了益母草總生物堿的提取、分離、鑒定，為進(jìn)一步把本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容做為藥學(xué)專業(yè)學(xué)生“天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)”課程開設(shè)提供最佳的實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)條件，達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

(1) 藥材。干燥益母草 (購自贛州市華爾康大藥房，粉碎后備用)。

(2) 試劑。濃鹽酸、濃硫酸(江西洪都生物化學(xué)有限公司)分析純；無水乙醇、甲醇(天津市大茂化學(xué)試劑廠)分析純；氫氧化鈉(天津市大茂化學(xué)試劑廠)分析純；氯化鈉固體(南昌鑫光精細(xì)化工廠)分析純；濃氨水(長沙市試劑化工廠)分析純；丙酮(中國上海試劑總廠)分析純；α-萘酚固體(上海亭新化工廠)化學(xué)純；薄層層析硅膠G(青島海洋化工有限公司)化學(xué)純；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)(0.5%)，超純水，碘化鉍鉀試液(按人民衛(wèi)生出版社第二版天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)配制)，三氯化鐵固體(天津市大茂化學(xué)試劑廠)分析純；強(qiáng)酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂(上海展云化工有限公司)。

(3) 實(shí)驗(yàn)儀器。分析天平(梅特勒，德國)；超純水器(Human up900，韓國)；RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；UV1900紫外分光光度計(jì)(上海亞研電子科技有限公司)；D2F-6050型真空干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法和結(jié)果

1.2.1提取和分離

(1) 水提醇沉。取干燥益母草粉末50 g，以1%HCl溶液水煎煮2次，溶劑用量分別為12、9倍量，提取時(shí)間均為1.5 h，趁熱過濾，合并濾液，冷卻，濃縮至相對密度約為1.10，加適量乙醇使其乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)80%，室溫靜置24 h，過濾，濃縮至25 mL，加5%HCl調(diào)pH2，過濾，得濾液。

(2) 陽離子交換樹脂前處理。取新732陽離子交換樹脂，用常水浸泡，反復(fù)用常水沖洗，去除水溶性雜質(zhì)，至洗出液澄明無色為止。用約樹脂2倍量的10%的NaCl水溶液浸泡24 h，裝柱，然后用5%的HCl洗滌，至洗出液為無色，蒸餾水洗至近中性，再以5%NaOH洗滌，至洗出液為無色，再以5%HCl洗滌，使陽離子交換樹脂轉(zhuǎn)為H型，并用超純水洗至pH6～7為止。

(3) 洗脫。濾液上離子交換柱，用超純水洗至不顯Molish反應(yīng)，加5%HCl洗脫[4]，未洗出生物堿，用3 mol/L NaCl溶液洗脫[5]，未洗出生物堿，用5%氨水洗脫，洗脫出生物堿，一段時(shí)間后不易洗出，收集5%氨水洗脫液。改用70%乙醇洗脫，易洗出生物堿，之后又不易洗出，收集洗脫液。再用5%氨水洗脫，易洗出生物堿，洗至生物堿的沉淀反應(yīng)呈陰性(用碘化鉍鉀檢測)，將2份含益母草生物堿的洗脫液濃縮，常壓75℃烘干，稱重，計(jì)算從50 g干燥益母草粉末中提取，用5%氨水和70%乙醇洗脫所得益母草生物堿的含量，含量W(%)=稱重重量(g)/50(g)。結(jié)果見表1。

表1 5%氨水和70%乙醇洗脫所得益母草生物堿的含量

1.2.2鑒定

(1) 生物堿的沉淀反應(yīng)。洗脫時(shí)接適量洗脫液于點(diǎn)滴板中，用鹽酸酸化，滴加適量碘化鉍鉀試液，迅速發(fā)生反應(yīng)，有橘紅色沉淀生成，故洗脫液中含生物堿。

(2) 薄層層析。分別取上述2份干燥生物堿適量溶于70%乙醇中，吸取適量點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)為黏合劑的硅膠G薄層板上，以丙酮-無水乙醇-鹽酸(10∶10∶1)為展開劑，在層析缸中放入一個(gè)裝有適量氨水的小燒杯，展開，取出，晾干，噴以碘化鉍鉀試液——1%三氯化鐵無水乙醇溶液(2∶1)顯色[13]，冷風(fēng)吹干，結(jié)果兩者都顯一個(gè)淡紅色斑點(diǎn)，Rf值均為0.77，表明兩者所含成分相同且為同一種物質(zhì)。

(3) 紫外光譜測量。分別取適量益母草生物堿標(biāo)準(zhǔn)品和上述2份干燥生物堿分別溶解于0.5%鹽酸甲醇、甲醇，為溶劑，在200～1 100 nm下掃描，得紫外圖譜，結(jié)果見表2、3。2份益母草生物堿的紫外圖譜基本一致。綜合以上鑒定，推測兩者所含生物堿成分很有可能相同。

表2 以0.5%鹽酸甲醇為溶劑的紫外光譜

表3 以甲醇為溶劑

2 討 論

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，用鹽酸水溶液煎煮提取益母草中生物堿，經(jīng)濟(jì)易行且能夠充分提取出有效成分，非常利于天然藥物化學(xué)學(xué)生實(shí)驗(yàn)的開展。

不同的炮制方法對益母草有效成分的的提取量不同[14]。文獻(xiàn)[15]用陽離子交換樹脂分離純化益母草生物堿的洗脫劑有鹽酸水溶液、氯化鈉水溶液、氨水及含有機(jī)溶劑的氨水等，且證明用鹽酸水溶液及氯化鈉水溶液洗脫效果更佳，但本實(shí)驗(yàn)均未洗脫出益母草生物堿，可能是由H+的洗脫能力較弱且洗脫時(shí)的流速不夠快導(dǎo)致。而用氨水及70%乙醇水溶液洗脫出生物堿，洗脫速度較快，由計(jì)算所得含量可知分離效果較好。傳統(tǒng)的陽離子交換樹純化生物堿工藝大多采用氨水堿化樹脂后氯仿提取法，引入毒性樹脂雜質(zhì)會減少樹脂使用壽命，洗脫率低，氯仿毒性大且被限制購買，成本高，一定程度上掩蓋了陽離子交換樹脂的真正優(yōu)勢，而用氨水及乙醇的洗脫率較高，毒性小，安全環(huán)保，成本較低，更利于學(xué)生實(shí)驗(yàn)的開展。兩者不同比例的混合溶液洗脫益母草生物堿的洗脫率值得進(jìn)一步研究，以確定兩者最佳比例的洗脫劑，甚至推廣至其他生物堿的分離純化和工業(yè)生產(chǎn)。

本實(shí)驗(yàn)的目的是為學(xué)生“天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)”課程開設(shè)提供最佳的實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)條件。購買標(biāo)準(zhǔn)品的成本很高，故薄層層析時(shí)未使用標(biāo)準(zhǔn)品作為對照。所得2份益母草生物堿在3種溶劑中的紫外圖譜基本一致，推測兩者所含成分相同。

[1] 周本宏, 馬郁文, 羅 毅. 超聲提取益母草總堿的工藝優(yōu)選[J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2006, 25(5): 451-452.

ZHOU Ben-hong, MA Yu-wen, LUO Yi. Technology Optim ization for U ltrason ic Ectraction of TotalAlkaloids from Leonurus[J]. Herald of Medicine, 2006, 25(5): 451-452.

[2] 李煥杰, 孟祥云. 不同溶劑及方法對益母草生物堿含量影響[J]. 陜西中醫(yī), 2008, 29(5): 607-608.

LI huan-Jie, MENG xiang-yun. Different solvents and methods on the effect of motherwort alkaloid content[J]. Shanxi Journal of Traditional Chinese Medicine, 2008, 29(5): 607-608.

[3] 徐 冰, 李寶泉, 馬 勇. 益母草有效成分的研究進(jìn)展[J]. 天津藥學(xué), 2003, 15(3): 68-70.

XU bing, LI Bao-quan, MA Yong. The review of effective components in Leonurus heterophyllus[J]. Tianjin Pharmacy, 2003, 15(3): 68-70.

[4] 李 萬, 蔡亞玲. 益母草總生物堿的藥理實(shí)驗(yàn)研究[J]. 華中科技大學(xué)學(xué)報(bào): 醫(yī)學(xué)版, 2002, 31(2): 168-170.

LI Wan, CAI Ya-ling. Pharmacological Studies of Total Alkaloids from Leonurus Heterop hyllus[J]. Acta Medicinae Universitatis Scientiae et Technologiae Huazhong, 2002, 31(2): 168-170.

[5] 姜水印, 黃品賢, 衛(wèi)洪昌,等. 益母草生物堿對大鼠急性心肌梗死后心功能的影響[J]. 上海中醫(yī)藥雜志, 2006, 40(10): 53-56.

JIANG Shui-yin, HUANG Pin-xian, WEI Hong-chang etc. Effects of Alkaloid of Leonurus Heteropyllus Sweet on Hear t Function After Myocardial Infar ction in Rats[J]. Shanghai Journal of Traditional Chinese Medicine, 2006, 40(10): 53-56.

[6] 劉 莉, 高 鵬, 李惠金. 益母草提取工藝優(yōu)選[J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2003, 9(2): 3-5.

LIU Li,GAO Peng,LI Hui-jin. Studies on Extracting Techniques of Herba Leonuri[J]. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae, 2003, 9(2): 3-5.

[7] 徐賢武, 陳科力. 陽離子交換樹脂富集純化益母草中總生物堿的工藝研究[J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2007,26(9):1067-1069.

XU Xian-wu,CHEN Ke-li. Study on Purif ication Process of TotalA lkaloids from Leonurus Heterophyllus byMeans ofCation Exchange Resin[J]. Herald of Medicine, 2007,26(9):1067-1069.

[8] 代 龍. 陽離子交換樹脂氯化鈉溶液洗脫純化益母草中總生物堿的工藝研究[J]. 江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2008, 20(6): 74-76.

DAI Long. The Research on the Technology of Purif icating TotalA lkaloids in Herba Leonuriw ith Sod-ium Chloride and Acidic Exchange Ion Resins[J].Journal of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, 2008, 20(6): 74-76.

[9] 徐小華, 杜紹亮, 楊 云. 益母草中總生物堿的提取及含量測定[J]. 河南科學(xué), 2008, 26(12): 1481-1483.

Xu Xiaohua,Du Shaoliang,Yang Yun, Extraction and Determination of the Alkaloid in Leonurus japonicus [J]. Henan Science, 2008, 26(12): 1481-1483.

[10] 從 悅. 益母草的化學(xué)成分和生物活性的研究[Z]. 沈陽藥科大學(xué), 2004: 24-25.

[11] 袁王俊,張維瑞,李 勉,等. 不同產(chǎn)地益母草中總生物堿含量的比較[J]. 河南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2013(1):38-39+65.

YUAN Wang-jun,ZHANG Wei-rui,LI Mian,etal. Comparison of total alkaloid contents in Leonuri Artemisia from different regions[J]. Journal of Henan University(Medical Science),2013(1):38-39+65.

[12] 鄧 屾,王 濤,吳春華,等. 益母草黃酮類成分的分離與鑒定[J]. 中國藥物化學(xué)雜志,2013(3):209-212,234.

DENG Shen,WANG Tao,WU Chun-hua,etal. Progress in folate receptor-mediated anticancer agent delivery[J]. Chinese Journal of Medicinal Chemistry, 2013(3): 209-212+234.

[13] 李 林. 水蘇堿的研究概況[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2009 , 37(3): 930-931.

LI Lin. Research Advances in Stachydrine[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2009 , 37(3): 930-931.

[14] 程軒軒,桑雪雨,楊 全,等. 不同炮制方法及提取溶劑對益母草有效成分含量的影響[J]. 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2013,22:1-4.

CHENG Xuan-xuan, SANG Xue-yu, YANG Quan,etal. Effect of different processing methods and extraction solvents on the content of active ingredients in Leonurus japonicus[J]. Chinese Journal of Hospital Pharmacy, 2013,22:1-4.

[15] 張加余. 陽離子樹脂純化益母草總堿和苦參總堿的工藝研究[Z]. 山東中醫(yī)藥大學(xué),2008:24-27.