黑龍江省馬鈴薯主栽品種遺傳多樣性的RAPD分析

趙光磊，張雅奎，吳凌娟，徐學譜，刁琢，

李功義1，梁杰1，董傳民1，溫福軍1，呂文河2*

（1.黑龍江省大興安嶺地區農林科學院，黑龍江加格達奇165000；2.東北農業大學，黑龍江哈爾濱150030)

遺傳育種

黑龍江省馬鈴薯主栽品種遺傳多樣性的RAPD分析

趙光磊1，張雅奎1，吳凌娟1，徐學譜1，刁琢1，

李功義1，梁杰1，董傳民1，溫福軍1，呂文河2*

（1.黑龍江省大興安嶺地區農林科學院，黑龍江加格達奇165000；2.東北農業大學，黑龍江哈爾濱150030)

應用RAPD標記技術對黑龍江省34份馬鈴薯主栽品種的遺傳多樣性進行分析，明確這些主栽品種的親緣關系，旨在為本區域馬鈴薯優良品種的選育提供理論依據。結果顯示，34條隨機引物共擴增出條帶185條，其中多態性條帶135條，占總條帶數的73%；34份供試品種可聚為3大類7亞類，遺傳距離在0.112～0.551之間，平均為0.364。結果表明，黑龍江省馬鈴薯主栽品種的遺傳相似性較高，遺傳基礎比較狹窄。

馬鈴薯；RAPD分析；遺傳多樣性；黑龍江省

DNA分子標記技術（如SSR，RAPD，ISSR和SPAR等）是進行種質資源的遺傳多樣性分析的重要手段[1-4]，其中RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)作為一種快速、簡便和通用性好的分子標記技術，一經問世，便得到了廣泛應用，目前，已成為生物遺傳多樣性研究的重要技術之一，尤其在馬鈴薯遺傳多樣性研究方面有很多報道，如楊先泉等[5]、劉福翠等[6]和邸宏等[7]分別研究了四川省、云南省和中國部分馬鈴薯品種的遺傳多樣性。然而，現有報道中多是對引進或育成多年的馬鈴薯品種進行分析，隨著近年來新育成品種在黑龍江省的推廣和種植，有必要針對黑龍江省馬鈴薯現有主栽品種的遺傳多樣性進行分析。為此，本研究應用RAPD分子標記技術對黑龍江省34份馬鈴薯主栽品種的遺傳多樣性進行了分析，旨在進一步了解這些品種的遺傳特性，以期為本省馬鈴薯種質資源的利用和雜交育種提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為34份黑龍江省馬鈴薯的主栽品種（表1），由黑龍江省大興安嶺地區農林科學院提供。Taq DNA聚合酶和dNTP為BioTeke公司產品；RAPD引物由上海生工生物技術公司合成；其他試劑均為進口分裝或國產分析純化。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

取各供試材料的幼嫩葉片，用植物基因組試劑盒（購自百泰克生物技術有限公司）提取DNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度化。

表1 34份供試馬鈴薯品種Table 1Thirty-four potato varieties used in this study

1.2.2 RAPD反應

PCR反應體系為25 μL，其中含有1×buffer，0.12 mmo1∕L dNTPs，0.8 μmo1∕L隨機引物，1.5 mmo1∕L Mg2+，1 U Taq DNA酶，40 ng模板DNA。

在工業自動化控制技術市場中，需求和供應之間存在供需矛盾的問題。需方需求的是完整的自動控制體系，以滿足自身制造工藝需要，而國內大多供應商提供的是各種標準化器件產品，不構成完整的控制體系，這極大的影響了我國企業自動化技術的發展。尤其是經濟全球化發展的趨勢下，國際間的經濟貿易往來十分頻繁，我國的制造業面臨著國內外雙重競爭壓力，低水平的自動化控制技術已經難以滿足我國制造業競爭力提升的需求。

PCR反應程序為94℃預變性4min，94℃變性30s，37℃復性40 s，72℃延伸1 min，40個循環；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR反應產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色觀察后，在紫外燈下照相記錄。

1.2.3 數據分析

將電泳圖譜上有帶的記為1，無帶和模糊條帶的記為0。根據RAPD數據使用NTSYS-pc2.10軟件，采用Nei和Li[8]的方法計算遺傳距離，并用非加權組對平均聚類法（UPGMA）進行聚類。

2 結果與分析

2.1 RAPD標記的多態性分析

以34份馬鈴薯品種的基因組DNA為模板，利用RAPD反應體系進行引物的篩選，從80條引物中篩選出穩定性好、條帶清晰、多態性豐富的引物34條，用于品種間的比較分析。利用34個多態性引物共擴增出DNA帶185條，其中多態性條帶135條，占總條帶的73%（表2）。其中擴增多態性條帶最多的引物為S376和S265，多態性條帶為8條（圖1）。

2.2 34份馬鈴薯品種的遺傳距離

根據擴增的多態性條帶，利用NTSYS軟件計算供試材料間的遺傳距離，結果表明，34份馬鈴薯品種之間的遺傳距離在0.112～0.551之間，平均為0.364。其中成對遺傳距離小于0.4的品種對有385個，占總數的68.63%，而成對遺傳距離大于0.5的品種對僅為1.25%（圖2）。上述結果說明，黑龍江省馬鈴薯栽培品種的遺傳距離狹窄，遺傳相似性較高，遺傳多樣性程度較低。

表2 不同隨機引物擴增出34份馬鈴薯品種的條帶數Table 2Numbers of DNA fragments amplified with different primers in 34 potato varieties

圖1 引物S376擴增的RAPD圖譜Figure 1Profile of amplified RAPD using primer S376

圖2 34份馬鈴薯品種間的成對遺傳距離分布圖Figure 2Frequency distribution of pairwise genetic distance of 34 potato varieties

2.3 34份馬鈴薯品種的聚類分析

應用UPGMA方法和NTSYS軟件對RAPD結果建立聚類樹狀圖（圖3）。從圖3可知，試供的34個品種可劃分為3大類，I類包括7個品種，Ⅱ類包括25個品種，Ⅲ類僅包括2個品種。

I類可分為3個亞類：I-1亞類包括2個品種，即‘底西芮’和‘夏波蒂’。I-2亞類有4個品種，包括‘麻皮布爾斑克’、‘大西洋’、‘東農305’和‘東農306’。I-3亞類僅有1個品種，即‘東農309’。

圖3 34份馬鈴薯品種的聚類分析Figure 3Dendrogram of 34 potato varieties by using UPGMA analysis

Ⅱ類在相似系數為0.65處，又分為3個亞類：Ⅱ-1亞類有19個品種，其中又可分為4個亞亞類，Ⅱ-1-1包括‘諾蘭’、‘興佳2號’、‘費烏瑞它’、‘克新22號’、‘訥引4號’和‘訥引5號’；Ⅱ-1-2包括‘中薯5號’和‘東農303’；Ⅱ-1-3包括‘超白’、‘春薯1號’、‘早大白’、‘興安紅’、‘東農308’和‘中大1號’；Ⅱ-1-4包括‘克新12號’、‘克新19號’、‘訥引1號’、‘尤金’和‘克新23號’。Ⅱ-2亞類有3個品種，即‘花園525’、‘東農307’和‘克新13號’。Ⅱ-3亞類有3個品種，即‘213’、‘克新18號’和‘克新4號’。

Ⅲ類僅包括2個品種‘訥引2號’和‘訥引3號’。

從聚類結果可以看出，國外育成品種或具有國外品種血緣的品種多聚在相同類群，如‘底西芮’、‘夏波蒂’、‘麻皮布爾斑克’、‘大西洋’、‘東農305’、‘東農306’和‘東農309’均聚在I類。‘諾蘭’、‘興佳2號’和‘費烏瑞它’也聚在Ⅱ-1-1中。

3 討論

研究結果表明，在80個隨機引物中篩選出的34個引物能在34份馬鈴薯品種間擴增出較好的多態性片段，共擴增出條帶185條，其中多態性條帶135條，占總條帶數的73%。分子聚類分析表明，34份馬鈴薯品種可聚為3大類7亞類。遺傳距離分析表明，黑龍江省34份馬鈴薯主栽品種之間的遺傳距離在0.112～0.551之間，平均為0.364，成對遺傳距離小于0.4的品種對占總數的68.63%。結果表明：黑龍江省馬鈴薯栽培品種的遺傳相似性較高，遺傳基礎比較狹窄，遺傳多樣性總體水平較低。

有報道認為，RAPD技術由于受反應條件的影響很大，假陽性率高，重復性較差，影響結果的準確性[9]，但筆者認為，只要嚴格地控制試驗條件，規范地進行試驗操作，增加試驗重復次數，是可以克服上述缺點的。前人的研究也證明，RAPD技術用于資源評價是有效可靠的，如Williams等[10]利用RAPD標記對蠶豆的66個后代材料進行遺傳分析，其結果符合孟德爾遺傳規律。國內外一些學者如Demeke等[11]、Del Rioa等[12]、李鳳云等[13]和李先平等[14]的研究進一步證明了RAPD標記可有效地用于馬鈴薯遺傳多樣性的研究。本研究結果發現，親緣關系較近的品種很早就聚在了一起，如‘超白’和‘春薯1號’、‘大西洋’和‘東農305’，根據對它們的系譜進行調查后發現與此結果吻合，由此也說明RAPD標記結果是可靠的。

研究表明，黑龍江省馬鈴薯栽培品種的遺傳相似性較高，遺傳基礎比較狹窄，這一結果與邸宏等[15]以及段艷鳳等[16]的研究結論一致。這是由于黑龍江省近年來審定推廣的馬鈴薯主栽品種主要來源于國外引進以及利用少數國外品種選育而成，造成了黑龍江省栽培的馬鈴薯品種整體上親緣關系較近。因此在今后的育種工作中應當加強引種和資源創新力度，創造豐富的變異材料，擴大種質資源的遺傳背景，促進馬鈴薯產業的持續發展。

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[4]楊平,劉仙俊,劉新春,等.利用SRAP標記研究四川高原青稞育成品種的遺傳多樣性[J].遺傳,2008,30(1):115-122.

[5]楊先泉,張佳,劉堅,等.應用RAPD分析四川馬鈴薯地方品種與部分栽培品種間遺傳關系[J].中國農學通報,2010,26(22): 40-44.

[6]劉福翠,譚學林,郭華春.云南省馬鈴薯品種資源的RAPD分析[J].西南農業學報,2004,17(2):200-204.

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RAPD Analysis of Genetic Diversity for Leading Potato Varieties
in Heilongjiang Province

ZHAO Guanglei1,ZHANG Yakui1,WU Lingjuan1,XU Xuepu1,DIAO Zhuo1,
LI Gongyi1,LIANG Jie1,DONG Chuanmin1,WEN Fujun1,LU Wenhe2＊
(1.Daxinganling Academy of Agriculture and Forestry,Jiagedaqi,Heilongjiang 165000,China;
2.Northeast Agricultural University,Harbin,Heilongjiang 150030,China)

The random amplified polymorphic DNA procedure(RAPD)was used to assess the genetic diversity for 34 leading potato varieties in Heilongjiang Province,which were to understand the genetic relationship of these leading potato varieties,and provide the theoretical basis for the breeding of potato varieties.The result showed that there were 135 polymorphic bands amplified with 34 primers,and the polymorphic rate was 73%;these 34 potato varieties were divided into threeclassesandsevensubclasses,andthegeneticdistanceamong34potatovarietieswasrangedfrom0.112to0.551,with an average of 0.364.These results suggest that the genetic similarity is high and the genetic base is narrow among leading potatovarietiesinHeilongjiangProvince.

potato;RAPD analysis;genetic diversity;Heilongjiang Province

S532

A

1672－3635（2014）02-0065-05

2014-03-05

現代農業產業技術體系建設專項（Zhsyz-1）；農業部公益性行業科研專項（3-6-1-6）。

趙光磊（1984-），男，碩士，主要從事馬鈴薯遺傳育種研究。

呂文河，教授，博士生導師，主要從事馬鈴薯遺傳育種研究，E-mail:luwenhe@yahoo.com。